22种中草药对南方根结线虫的防杀活性研究

22种中草药对南方根结线虫的防杀活性研究

1855年，corm第一次在英国的黄杨树根发现根虫，并于1879年首次在其名称为根虫。它是世界上影响最大的原生动物之一，也是人类最严重的疾病之一。国外20世纪80年代就已经开展了大量植物源杀根结线虫活性药剂的研究,尤其是随着标志植物源农药又被重新大力推广和应用的印楝素的发现和成功合成,植物源药剂对根结线虫的致死活性研究被一步步推向更广的资源搜集、更深的机理研究方向发展。但是我国近代系统的针对杀线活性的植物源药剂进行研究的文献报道仅起于20世纪90年代初期。王翠萍1991年译制了Tiyag发表的关于用香茅叶提出物浸根防治植物寄生线虫的研究报道。随后,我国植物源杀根结线虫活性药剂的研究逐步由学习和引入转变到实验性筛选和生理变化研究方面[7,8,9,10,11,12,13,14,15]。本研究选取了在中国传统中草药中具有杀虫效果的22种中草药植物,通过直接触杀实验研究其不同溶剂和不同提取手段条件下所得提取物的杀根结线虫活性。1供试线虫及材料供试植物:18科22种中草药,具体见表1。供试线虫:南方根结线虫(Meloidogyneincognita),虫样采自西安市高陵县通远镇蔬菜大棚基地生长的染病芹菜根系。2测试方法2.1卵囊的消毒处理剖开已感染南方根结线虫的芹菜根系,在实验室内通过贝尔曼漏斗法提取虫体,从所得虫体中挑取卵囊,卵囊用0.2%次氯酸钠溶液消毒0.5min后,经无菌水冲冼。置卵囊于无菌水中孵化,取2d后孵出的线虫(2龄线虫,简称J2)供测定用。2.2提取与萃取方法不同溶剂提取:对供试植物进行粉碎、过筛(250µm)后,称取5.0g植物粉末分别置于50mL乙醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮中,在25℃恒温摇床中震荡提取24h,所有提取液过滤去除滤渣,得澄清溶液经旋转蒸发,所得固体粉末配成20%乙醇水溶液,待试验用。不同方法提取:取粉碎后5.0g植物粉末置于100mL沸水中煮提20min;称取5.0g植物粉末置于100mL冷水中浸泡30min,在2450MHz条件下提取2min;称取5.0g植物粉末置于100mL冷水中浸泡30min,在25kHz/40kHz交换频率下室温超声30min。各提取液过滤去渣,得澄清溶液,待试验用。对胡黄连、狗脊水煮提取物的萃取分离:取粉碎后的100g植物粉末置于500mL沸水中煮提20min,过滤后取澄清滤液用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对萃取有杀线活性部分进行依次萃取,流程见图1。其中各有机溶剂萃取,均经过浓缩后再水溶,供后步萃取继续使用,并对萃取各有效部分,记录72h内梯度受试浓度下线虫的死亡率。使用DPS软件对结果进行统计分析,计算LC50值。2.3虫体活动情况观察试验采用提取液与虫样液共混直接触杀,虫样浓度1000~1200只/mL;100~400倍显微下连续观察72h,记录虫体活动变化情况。同时设置0.5%的乙酸乙酯、石油醚、丙酮的水溶液和10%、20%、30%乙醇水溶液的空白试验。3溶剂提取试验结果3.1有机溶剂提取所得结果见表2。通过空白试验发现20%乙醇水溶液对受试南方根结线虫2龄幼虫不存在明显杀线活性,可以被用作有机溶剂提取成分线虫活性触杀试验的载体溶液。3.2不同溶剂的萃取、杀线效果所得结果见表3。3.3不同方法的液体提取效果所得结果见表4。3.4萃取流程和流程对胡黄连水煮提取物进行萃取,在流程图1中的水部Ⅱ和乙酸乙酯萃取Ⅴ部表现出强杀线虫作用,72h内杀线率达到100%;对狗脊水煮提取物进行萃取,在流程图1中的水部Ⅱ、水部Ⅳ和正丁醇萃取ⅩⅢ部表现出强杀线作用,72h内杀线率达到100%。萃取物的半数致死剂量见表5。4中草药提取工艺的研究对22种中草药采用不同溶剂和不同手段提取所得成分进行了系统的杀根结线虫活性研究,得出以下结论。具有强杀根结线虫活性的提取液。72h内受试虫体死亡率保持在90%(BB级)以上为具有强杀线活性。其中有胡黄连、木香、蛇床子、瞿麦和吴茱萸的乙酸乙酯提取液;甘草、花椒和石榴皮的乙醇提取液;艾蒿、木香和蛇床子的丙酮提取液;胡黄连和狗脊的水煮提取液;胡黄连、木香、天门冬和石榴皮的微波提取液;天门冬和石榴皮的超声提取液,并且胡黄连、木香、蛇床子和石榴皮在多种提取方式下,均能提取出较强的杀线活性成分,而各种中草药的石油醚提取液则未检出具有强杀线活性的提取部分。提取方式对杀线活性产生的差异。1)对同一种中草药采用不同溶剂提取比采用不同提取手段提取所得的杀线活性的差异性要大,如艾蒿仅在丙酮提取液以及瞿麦和吴茱萸仅在乙酸乙酯提取液中具有强杀线活性,其他溶剂提取方式则均表现出极弱的杀线活性。所以对研究大部分中草药植物的杀线活性来说,选取合适的溶剂是得到特定活性成分的关键。2)选取不同的提取手段则能够在提高活性物质的提取效率上产生积极影响。如对蛇床子、小茴香、甘草、木香、天门冬、石榴皮、贯众和百部采用微波和超声提取比水煮提取,明显提高了其杀线活性物质的提取率,大大缩短了提取时间。虫体受试期内活性的变化。在对22种中草药提取液的杀线活性研究中发现部分中草药提取液在72h的线虫触杀试验过程中,表现出明显的逐渐复活现象。其杀线活性在72h内从BB级以上变化到C级以下的13种中草药的提取液有:鱼腥草的乙酸乙酯提取液和水煮提取;小茴香的石油醚、丙酮和水煮提取液;甘草的乙酸乙酯、石油醚、丙酮和水煮提取液;番泻叶的丙酮和超声提取液;槟榔的乙酸乙酯、丙酮和微波提取液;石榴的石油醚和丙酮提取液;白头翁的乙酸乙酯提取液;百部的乙酸乙酯、丙酮提取液;艾蒿的乙酸乙酯提取液;吴茱萸的丙酮提取液;花椒的乙酸乙酯提取液;萹蓄的丙酮提取液;贯众的超声提取液。这一现象和结果说明这些提取液成分具有的杀线活性是暂时性的,即可能是对根结线虫起麻痹作用,在数十小时,甚至数小时之后,麻痹作用失效和复活;也可能是由于活性成分不稳定的转变成了其他非活性物质。所以在触杀实验的过程中,必须将受试虫体于清水中复活以确认杀线活性效果。杀线LC50值的对比。目前文献已报道多种具有较强杀根结线虫活性的植物源化合物,如丁琦等报道的对苯二酚、丁子香酚、苦豆碱等13种植物源化合物中具有较强杀线活力的植物源化合物LC50<100mg/L;朱卫刚等报道了生物农药阿维菌素对南方根结线虫的LC50值为1.48mg/L。本研究中,胡黄连乙酸乙酯萃取Ⅴ部对南方根结线虫2龄幼虫的LC50值为81.44mg/L,狗脊正丁醇萃取ⅩⅢ部对南方根结线虫2龄幼虫的LC50值为67.37mg/L。相对于高成本农用生物制剂,将胡黄连和狗脊的提取物进行农用制药,从成本和室内触杀效果的角度上看不失为一个有颇有前景的开发方向。5高效杀菌活性植物提取物的筛选就22种中草药的提取物杀根结线活性进行了系统研究,发现胡黄连、狗脊、木香、蛇床子、石榴皮、瞿麦、吴茱萸、甘草、花椒和艾蒿10种中草药的提取物具有较强的杀根结线虫活性,测定了胡黄连和狗脊萃取提取物的杀线LC50值,并且胡黄连、木香、蛇床子和石榴在多种提取方式下均能提取出较强的杀线活性成分,可以被用作进一步的杀线机理和活性稳定性研究。然而作为杀根结线虫活性植物源农用药剂的研究,尤其是在我国,目前仅处于杀线活性植物资源的筛选阶段,从我国传统