植物寄生线虫的危害及防治

植物寄生线虫的危害及防治

植物寄生虫是危害农业的重要致病性生物之一。它分布广泛，种类繁多。主要是寄生虫、果树、谷物、树木和观赏植物。据估计,全世界主要农作物因植物寄生线虫造成的年损失率约为12.3%,1987年由植物寄生线虫造成的农业经济损失就达700亿美元,2003年损失高达1250亿美元。同时它常使真菌和细菌易于侵染植物,是诱发植物病害的重要原因之一。植物寄生线虫具有非常典型的口针,且绝大多数是专性寄生的。其寄生部位因种类不同而异,除少部分在寄主地上部的茎、叶、花、芽和果实上取食外,大多数线虫危害植物的根部。按其寄生部位和方式的不同分为外寄生或内寄生和迁徙型或栖居型。外寄生线虫虫体不进入植物组织内,仅在植物体表取食,多属于迁徙型。只有栖居型内寄生线虫同寄主植物之间建立和维持着一种非常紧密的关系。多数植物寄生线虫的生活史是相似的,主要包括3个发育阶段:卵、4个幼虫期和成虫期。在适宜的条件下,卵发育为1龄幼虫,1龄幼虫在卵壳内发育并进行第1次蜕皮,成为2龄幼虫。2龄幼虫从卵中孵化出来进入土壤,选择植物根部适合部位侵入植物体内并到某一位点。在此位点的植物细胞被诱导形成一个永久性的取食结构,其功能是为线虫提供生长和繁殖所需的营养物质。取食过程中线虫不再移动,完成3次蜕皮发育成成虫。线虫生长发育受多种因素影响,线虫的种类、危害的方式、寄主植物的生长状况、气候条件、土壤环境等都与生活史长短有关。为了寻求较好的防治植物寄生线虫的方法,国内外的科学家对温度、湿度、化学物质以及虫口密度对植物寄生线虫发育和病害发生程度的影响做了一些研究。目前,植物寄生线虫发育的研究还停留在器官的组织细胞结构特点和发育形态表观变化上,而从遗传学的角度揭示植物寄生线虫的发育过程和机理的研究还比较少。1理想国里的胚胎发育情况线虫的发育遵循大多数多细胞生物的发育原则,依靠细胞间的相互作用调节发育过程的细胞分裂、分化及命运,因此初期学者们多从一般细胞学角度研究线虫的胚胎发育情况。Raski描述过甜菜胞囊线虫(HeteroderaschachtiiSchmidt)的胚胎发育情况,Bird和Stynes对爪哇根结线虫(MeloidogynejavanicaTreub)和剪股颖粒线虫[Anguinaagrostis(Steinbuch)Filipjev]的胚胎发育情况做了更深入的研究。关于植物寄生线虫的胚胎发育及生活史的研究国内也有少量报道,而从遗传学的角度揭示植物寄生线虫胚胎发育机理的研究国内外鲜有报道。2004年Elena从马铃薯金线虫[Globoderarostochiensis(Wollem)Skarilorich]中分离得到调控线虫卵孵化的金属蛋白矩阵基因(matrixmetalloproteinasegene),该基因在胚胎发育过程中通过调控金属离子,来调控卵孵化过程中所需的一些酶的活性,进而达到控制卵的孵化的作用。2glp-1、lin-12在信号通路中的作用线虫的发育过程中有大量的基因共同表达系统对线虫发育进行调控,不同基因控制着线虫不同器官——生殖系统、神经系统、表皮组织等的形成。通过对模式动物秀丽小杆线虫(CaenorhaditiselegansMaupas)的研究,发现了细胞信号传递成分。例如G蛋白的α亚基、β亚基以及酪蛋白激酶Ⅱ等。与之相关基因的获得对于阐明线虫发育的分子信号过程是极为有利的。在秀丽小杆线虫中发现glp-1主要参与由DTC诱导的生殖腺增殖以及胚胎发生中前咽的形成过程。Lin-12主要负责调节均等组中成员的细胞命运决定。glp-1和lin-12编码的可能是丰富的细胞表面受体,虽然它们在功能上相似,但由于表达在不同的组织中,所以各自调节的信号过程也不同。调节线虫阴道发育的信号过程是由酪氨酸激酶2Ras介导的途径,lin-15是阴道正常发育所必需的,它通常在合胞体皮下组织(hyp7)中表达,负责阻遏相联的VPC的VH命运。Lin-3在锚细胞中表达,编码的蛋白质是阴道发育的诱导信号。Sem-5及let-60基因均作为正调节元件起作用,负调节元件lin21位于信号通路的最下游。如lag-1及lag-2作为正调节元件作用于glp-1和lin-2的下游。还有决定寿命时间的基因clk-1、促进雄性发育的基因xol-1、同源异型基因(homeobox)等。线虫的发育是多个细胞相互作用的信号过程调控的结果。3功能调节方面的研究随着分子生物学的发展,人们对植物寄生线虫的研究也在不断地深入,对植物寄生线虫与寄主植物的互作、寄生过程中寄生相关基因进行了较多研究(表1)。而国内外对植物寄生线虫发育基因方面的研究还少有报道。2001年Veronico克隆了不列颠根结线虫(M.artielliaFranklin)的几丁质合成酶基因,并对基因的结构、表达和功能进行了研究;2005年Elena利用RNAi技术对该基因进行功能分析,证实其在线虫发育中的作用。1999年Piotte克隆了爪哇根结线虫和南方根结线虫(M.incognitaChitwood)的乙酰胆碱酯酶基因。随后,Laffaire于2003年从南方根结线虫中分离了另一个乙酰胆碱酯酶基因Mi-ace-2,并对该基因的功能及各个生长阶段的表达情况进行了研究,这为植物寄生线虫的防治寻找新靶标提供了理论依据。2007年Kimber利用RNAi技术,研究马铃薯白线虫[Globoderapallida(Stone)Mulvey&Stone]具有调控器官感觉及运动功能的FMRF酰胺相关肽基因flp。研究结果显示该基因主要调控马铃薯白线虫的运动活性,并且该基因的dsRNA也较易被马铃薯白线虫吸收。在植物寄生线虫的防治研究过程中,神经系统已公认是一个非常好的作用靶标,因此FLP的信号传导过程,是潜在的具有重大意义的防治靶标。Andrea研究了大豆胞囊线虫(H.glycinesLchinohe)的17β-羟类固醇脱氢酶基因Hg-hsd-1和Hg-hsd-2,试验表明基因在成熟雌虫中高度表达,而在卵和2龄幼虫中极少表达,从而推测其在线虫的繁殖或卵子发生过程有重要作用。Catherine等克隆了大豆胞囊线虫氨肽酶基因Hg-amp-1,原位杂交试验表明2龄幼虫生殖原基和成熟雌虫生殖区高度表达。4一般研究方法和技术4.1数据库的基因测序随着分子生物学的发展,许多先进的方法和技术不断地被应用到植物寄生线虫的研究领域中来。目前获得功能基因常用的方法有:候选基因策略、差异显示方法、mRNA差异显示等。利用这些方法已经从植物寄生线虫中成功分离出编码β-1,4-内切葡聚糖酶、纤维素酶、果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶和乙酰胆碱酯酶的基因等,以及大量的表达序列标签(expressedsequencetags,ESTs)。从表达序列标签中也可以鉴定候选基因。目前,各种数据库中的根结线虫各个发育阶段的ESTs序列已经达到了36000个,各种动物寄生线虫的EST也达到了156000个。此外,自由生活线虫秀丽小杆线虫全基因组测序的完成,更使得这些方法如虎添翼。获得未知基因的部分cDNA序列后,还要寻找全长cDNA,以便对基因结构与功能进行研究。目前钓取基因全长的方法主要有cDNA文库筛选法和根据EST的序列信息利用RACE技术获得全长等。前者工作量大、费用高,但其筛选质量高,现已逐步应用到植物寄生线虫的基因分离领域;现行的SMARTRACE技术利用了PCR抑制效应(PCR-suppressioneffect)和Touchdown技术,有效地提高了cDNA末端快速扩增的灵敏度,降低了背景,提高了效率。4.2非同位素原位杂交原位杂交(insituhybridization,ISH)是在分子生物学领域应用极为广泛的试验技术之一,是在研究生物体发育过程中一种极为重要的分子遗传学研究方法。自1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾(XenopuslaevisDaudin)细胞核内的rDNA获得成功之后,人们在此基础上不断改进而发展到非同位素原位杂交技术(nonisotopicinsituhybridization,NISH),不仅操作简单而且提高了基因定位的准确性。自从Gerhard等于1981年成功地将人单拷贝α球蛋白DNA序列定位到16号染色体上后,原位杂交技术也越来越多地应用于非重复顺序基因定位的研究。从基因定位的准确性来看,原位杂交方法可以将基因定位在某一染色的特定区段上,这是其它定位方法无法比拟的。因此,原位杂交是比较理想的一种基因定位技术,越来越多被各国学者所采用。并在植物寄生线虫上也得到了较成熟的应用,已有多种寄生相关基因例如β-1,4-葡聚糖酶、分支酸变位酶基因等被成功定位于根结线虫等线虫的食道腺内。由于原位杂交探针的特异性,可用不同标记物来标记不同探针同时进行多基因的定位,在同一标本上或同一细胞内同时检测2种以上的靶核酸序列,这种方法即双重标记原位杂交技术。4.3国家机器rnai研究目前已从植物寄生线虫中克隆到许多已知的和未知的基因,RNAi技术则成为一种快速、有效、直接的研究这些基因在线虫发育及线虫与寄主互作等过程功能的一种有效方法。1dsrna的缺失1998年首先在自由生活线虫秀丽小杆线虫中发现了由双链RNA触发的RNA沉默,RNAi的作用机理简单地讲是指双链RNA引起基因沉寂的过程。在线虫中,导入细胞的dsRNA可以是几百个碱基的长度,也可以是几千个碱基。最早的实验发现,短于100bp的效果是很差的。当dsRNA进入细胞后,被一种叫Dicer的酶切成21~23bp的短片段。Dicer是一种进化上保守的RNA酶Ⅲ蛋白酶,最初是在果蝇(DrosophilamelanogasterMeigen)中发现的,这种蛋白质在线虫中被称为DCR-1蛋白,它与线虫中的RDE-4、RDE-1及DRH-1(一种RNA解旋酶)组成复合物,共同参与siRNA的产生,这对注入的dsRNA的有效加工是必要的。线虫的其他蛋白因子,如MUT-7、MUT-8、MUT-14和MUT-15等多数存在于线虫生殖系组织中(MUT-15例外),它们都参与了RNAi过程,但对这些蛋白在RNAi反应中的确切作用仍不很清楚。2dsrna浸泡RNA干扰现象最早在线虫中发现,现在已成为反向遗传学方法的重要研究工具。在模式动物秀丽小杆线虫的RNAi研究过程中,导入的方法包括显微注射法、喂食发、浸泡法。而对于植物寄生线虫来说,比较有效的dsRNA导入方法为浸泡法,通过虫体浸泡在dsRNA溶液中将dsRNA导入线虫体内引起基因沉默。为了有效地进行RNA干扰,可以把植物寄生线虫浸泡在dsRNA溶液中,dsRNA可以通过体表口腔等多个部位进入虫体,这种方法适合线虫的任何生长阶段,更有利于研究不同生长阶段基因功能。浸泡成虫后分析它的F1代,主要分析mRNA的表达丰度。当浸泡幼虫后,在其浸泡后的发育中就可以分析相关的表型变化。相对微注射法,浸泡减少了劳动强度,也不需要一些进行注射所需要的特殊仪器设备。同时若干组试验可以同时进行,dsRNA的合成以及线虫的浸泡都可以在96孔板中进行,有利于对相关基因进行高通量分析。现今利用该方法在研究植物寄生线虫的基因功能和系统分类方面已取得了一些重要成果[16,19,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54]。3rt-pcr法检测基因mrna对于线虫RNAi试验效果,可以从蛋白质和mRNA2个方面进行检测。通常采用Westernblotting、ELISA、免疫荧光等技术检测蛋白表达水平。而对于mRNA的转录水平,可用RT-PCR、定量PCR、Northernblotting或RNA酶保护试验(RNaseprotectionassay,RPA)等,通过信号强弱判断目的基因mRNA的沉默效果。其中,RNA酶保护试验不管从灵敏性、特异性或稳定性等方面都优于传统RT-PCR和Northern杂交。它是利用标记的反义RNA作为探针(可用生物素,如DIG标记),将含过量探针的溶液与样品总RNA杂交,经RNA酶处理后,未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解,而目标RNA则因与探针结合形成双链而得到“保护”。RNAi效率检测方面,realtime-PCR技术在对线虫的几丁质合成酶基因功能研究过程中取得了较为成功的应用,同时利用FITC(fluoresceinisothiocyanate)跟踪检测dsRNA的沉默效率,并用DIG标记探针的原位杂交技术检测基因敲除后的基因表达情况,也在对根结线虫编码咽腺蛋白的基因进行干扰的试验中得到了较好的运用。5植物寄生虫线虫基因表达目前,植物寄生线虫的发育生物学研究已经取得了一定进展,但植物寄生线虫发育基因的研究还很少。相对于模式动物秀丽小杆线虫所发现的大量发育基因来说,目前只是研究了很少的植物寄生线虫的发育基因,目前还没有对某一发育现象的各种基因进行系统研究,更没有对基因之间的联系及其作用机理进行深入