补肾益气方药对d-半乳糖致衰老模型大鼠脑sod活性、mda及海马pka、creb、c-fos表达的影响

补肾益气方药对d-半乳糖致衰老模型大鼠脑sod活性、mda及海马pka、creb、c-fos表达的影响

衰老是生物界普遍存在的自然现象。在衰老的过程中,机体出现各种生理功能下降或紊乱,伴随着机体的老化,学习记忆也逐渐减退。据联合国的预测,到2010年,中国60岁及65岁以上人口比重分别为12.3%和8.1%,2020年更将达到16.7%和11.5%,表明我国已经进入人口老龄化国家行列。随着生活水平的提高,如何提高老年人的生存质量,延年益寿,已经成为国内外研究的热点,具有重要的现实意义。近年来国内外研究报道发现,cAMP(环磷酸腺苷)/PKA(cAMP依赖的蛋白激酶)/CREB(cAMP应答元件结合蛋白)信号传导体系和突触可塑性及长期记忆的形成密切相关,在调节学习和记忆形成过程中起了重要的作用。本课题组以往研究也表明,AD模型大鼠脑组织cAMP/PKA/CREB信号转导通路的确存在一定程度的异常,从而导致其学习记忆能力的减退。中医认为“肾藏精,主骨生髓”,肾精虚衰在衰老中具有重要地位。故以中医衰老肾虚理论为指导,在以往研究的基础上,采用大剂量D-半乳糖腹腔注射制造衰老模型大鼠,观察大鼠空间学习记忆能力以及和学习相关的cAMP/PKA/CREB信号转导通路中关键分子的表达变化,以进一步探讨补肾益气方药——益气聪明汤及其加减方改善老年人记忆减退、认知障碍的作用机制,为临床运用该方药延缓衰老提供实验依据。1材料和方法1.1动物许可证:scxk沪雄性SD大鼠,清洁级,体质量(250±30)g,上海中医药大学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(沪)2008-0016。经环境适应性饲养2d后,按大鼠体质量随机分为4组:青年对照组、D-半乳糖致衰老组(简称衰老组)、益气聪明汤组及加减益气聪明汤组。1.2对大鼠的饮料配方益气聪明汤:由黄芪、炙甘草、党参、升麻、葛根、蔓荆子、白芍药及黄柏组成;加减益气聪明汤:由黄芪、党参、炙甘草、升麻、川芎、葛根、蔓荆子、白芍药、何首乌及肉苁蓉组成。将各方药按传统方法水煎成剂,并加以浓缩,-30℃保存,临用前稀释饮用。从造模之日起,益气聪明汤及加减益气聪明汤组大鼠予以饮用稀释药液,连续56d,每鼠用药剂量相当于成人每千克体质量剂量的10倍;青年对照组和衰老组大鼠均正常饮水饮食。1.3乳化、注射分析方法除青年对照组外,其余各组均腹腔注射D-半乳糖生理盐水300mg.kg-1·d-1,连续注射56d;青年对照组腹腔注射等量0.9%NaCl溶液,连续56d。1.4单克隆抗体crebSOD测试盒、微量MDA测定试剂盒,南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠多克隆抗体(PKA),武汉博士德生物工程有限公司;小鼠抗兔单克隆抗体(CREB),CellSignaling;兔抗人单克隆抗体(c-fos),CellSignaling;HRP标记山羊抗小鼠IgG,JacksonImmunoResearch;HRP标记山羊抗兔IgG,JacksonImmunoResearch;ECL试剂盒,Pierce;DAB显色试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;预染蛋白Marker,Fermentas。1.5平台设置及时间采用Morris水迷宫法。实验前动物自由游泳2min。平台设于迷宫西南象限正中(训练期间平台位置固定),水面高出平台1.5cm,水温保持在19℃～20℃,大鼠连续训练5d,每天2次,分别从正北、正东两个起始点投放,设定最长游动时限为70s,电脑自动计时,记录大鼠找到平台所需要的时间,即潜伏期。如果大鼠70s内未能找到平台,潜伏期记为70s,同时将其引至平台上,在平台上停留20s。记录每天各组大鼠2次潜伏期的时间(s),取均值进行统计学评价。1.6sed活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法,具体操作按照试剂盒说明进行。1.7脑中sda含量的测量采用TAB法,具体操作按照试剂盒说明进行。1.8通过worm-b检验家谱动物，如pga、creb和c-fos蛋白1.8.1上清液制备分离出大鼠海马,称重后,按900μl/100mg组织加RIPA冰浴匀浆后立即加100μlPMSF液,再将其转移到1.5ml离心管中并加40μlcompletemini液,4℃,10000r/min离心10min,取上清液-70℃冻存,24h后4℃10000r/min再次离心10min,从中取出少量用于蛋白含量测定,其余上清分装-70℃保存待用。1.8.2蛋白凝胶电泳安装好电泳装置后首先进行灌胶,采用10%的分离胶及4%的浓缩胶,按蛋白定量的结果上样后进行电泳,条件为60V先行电泳60min,后将电压改为100V,直至指示剂接近平板底部时停止电泳。1.8.3反b一抗b将转膜装置安装好后,4℃条件下恒流(400mA)转膜90min,拆除转膜装置,将膜取出,37℃条件下,5%脱脂奶粉封闭1h,后加入一抗(PKA为1:800倍稀释,CREB为1:400倍稀释,c-fos为1:800倍稀释),4℃过夜;次日取出膜用0.1%PBST洗膜4次,每次10min,再加入二抗(ECL显色为1:2000倍稀释,DAB法显色为1:400倍稀释),37℃孵育40min,将膜取出,0.1%PBST洗膜4次,每次10min,接下来进行ECL显色(PKA和c-fos)及DAB显色(CREB),并进行光密度值的统计分析。1.9统计方法数据统计采用单因素方差分析方法。应用SPSS11.0在PC上进行处理,以SNK法进行各组间的两两比较。2结果2.1对老龄化大鼠材料后理单次学习记忆能力和刑期8由结果可见,各组大鼠随着训练次数的增多,找到平台所需的时间(潜伏期:s)呈逐渐缩短趋势。其中,第1天到第3天各组之间的潜伏期差别无统计学意义,但从数值上看,衰老组大鼠潜伏期最长;从第4天开始,加减益气聪明汤组大鼠潜伏期较衰老组大鼠明显缩短(P<0.05),第5天益气聪明汤期与衰老组相比亦明显降低(P<0.05);与青年对照组相比,衰老组5d的潜伏期均有延长的趋势,提示衰老大鼠空间学习记忆能力逐渐减退;补肾益气方药对衰老大鼠的空间学习记忆减退有一定的改善作用。见表1。2.2mda含量测定由结果可见,与青年对照组相比,衰老组大鼠脑SOD活力明显降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05);用药后,益气聪明汤组及加减益气聪明汤组大鼠脑SOD活力均较衰老组大鼠显著提高(P<0.05),而MDA含量则明显降低(P<0.05)。见表2。2.3对小鼠海马pka、creb及c-fos蛋白表达的影响与青年对照组相比,衰老组大鼠海马PKA、CREB及c-fos蛋白表达均明显降低(P<0.05);益气聪明汤组、加减益气聪明汤组大鼠海马PKA、CREB及c-fos蛋白表达均较衰老组大鼠显著升高(P<0.05)。见表3,图1-图3。3平台治疗组衰老是生物体全身各组织、器官的退行性变化,是诸多病理、生理过程综合作用的结果。关于衰老机制的学说有很多,其中比较有影响力的有美国学者Harman提出的自由基学说;BokovA等也认为衰老是自由基对细胞成分的有害进攻造成的。本研究采用D-半乳糖腹腔注射制造衰老模型大鼠,D-半乳糖致亚急性衰老模型的主要原理是半乳糖过量时,半乳糖氧化酶催化生成醛糖和过氧化氢,产生超氧阴离子自由基,大量的自由基能够氧化生物体内的生物大分子,导致氧化损伤,从而加剧衰老。该方法制造的亚急性衰老性动物模型不仅能较好地模拟与自然衰老相似的代谢紊乱特征,同时具有学习记忆功能下降的衰老表现。我们的研究结果也表明,与青年对照组比较,衰老大鼠脑组织SOD活性降低,MDA含量增高,提示衰老大鼠体内存在一定程度的氧化损伤,益气聪明汤和加减益气聪明汤可通过提高抗氧化酶SOD的活性、降低脂质过氧化产物MDA的生成,提高衰老大鼠抗氧化能力。衰老对于脑而言,其增龄性变化中最明显的表现就是学习记忆的减退。本研究中,采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力,结果显示,衰老大鼠找到平台所需时间相对于青年对照大鼠有延长的趋势,存在一定的空间学习记忆能力减退;而补肾益气方药——益气聪明汤和加减益气聪明汤对衰老大鼠存在的空间学习记忆减退均有一定的改善作用。虽然衰老性学习记忆减退的具体机制目前并不十分明确,但国内外的大量报道及我们前期的研究结果均表明,cAMP/PKA/CREB信号传导体系和突触可塑性及长期记忆的形成密切相关,在调节学习和记忆形成过程中起了重要的作用。PKA是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它和LTP(长时程突触传递增强)及LTD(长时程突触传递抑制)有关,还和海马长期记忆的形成有关;CREB也被证明和记忆尤其是长期记忆的形成有关,具有调节包括学习记忆在内的广泛的生物学功能,是细胞内多条信号通路的一种关键成分。有关c-fos的研究很多,最早在进行行为训练和学习认知的研究中发现,上述行为可诱导c-fos的表达,因此提出c-fos参与学习记忆的形成。虽然对于学习记忆诱导c-fos基因的表达的确切机制,目前尚未完全明确,但有研究表明第二信使(如钙离子、cAMP等)均参与了这种诱导。故我们对该信号转导通路中上述关键分子进行研究,实验结果表明:与青年对照组相比,衰老大鼠海马组织PKA、CREB及c-fos的表达均明显降低,提示老年性学习记忆减退可能与该通路的异常有一定的关系。从中医的角度来看,老年性学习记忆的减退属于“呆症”和“健忘”范畴,其病位在脑而本于肾。本病属本虚标实之证,本虚为肾精亏虚兼气虚,标实为血瘀、痰湿。治疗当以标本兼顾,治法宜益气升阳、补肾填精、活血除痰、通脑开窍。本研究采用补肾益气方药——益气聪明汤及其加减方加减益气聪明汤,旨在升阳益气、补肾益精通脑。两方中黄芪、党参、炙甘草等补