测试药对结肠癌皮下移植瘤模型生长作用的初步研究

测试药对结肠癌皮下移植瘤模型生长作用的初步研究摘要目的以人结肠癌COLO205细胞株建立人源化小鼠皮下移植瘤模型,测试药物对此肿瘤模型生长的作用。方法将连续培养十代之前的人结肠癌COLO205细胞，以约5×106的数量接种于每只小鼠背部靠近腋右下方皮下。当肿瘤生长到平均约100-150mm3左右时，48只小鼠根据肿瘤大小和体重被随机分成6组，每组8只。分组后小鼠经腹腔注射的方式进行给药，每两天给药一次，一共给药14次，每周测量肿瘤体积两次，连续4周。结果实验期间，人结肠癌细胞COLO205皮下移植瘤模型在本实验中成功的建立。阳性药5-FU组、5-FU+测试药高剂量组、5-FU+测试药中剂量组、5-FU+测试药低剂量组小鼠给药后瘤体积增长相对缓慢，与同期空白对照组相比瘤体积相对较低，有显著差异（p<0.05）。测试药组给药后体积增长相对缓慢，与空白对照组相比，瘤体积相近，没有显著差异（p>0.05）。结论经实验显示测试药与5-Fu联合用药有抑制肿瘤生长的趋势。【关键词】结肠癌皮下移植瘤模型测试药COLO205细胞目录1前言1研究背景1研究现状11.3研究的目的和意义12材料与方法22.1实验材料22.1.1实验动物22.1.2仪器22.1.3试剂22.2实验方法32.2.1细胞培养和接种32.2.2动物分组和给药方法32.2.3动物观察32.2.4检测指标42.2.5实验停药和恢复给药标准42.2.6实验动物人道终点42.2.7实验结束后安乐死及实验终点42.2.8统计分析43实验结果与讨论53.1测试药对实验动物的反应和体重变化53.2测试药对肿瘤体积、相对肿瘤体积及相对肿瘤抑制率的影响变化...63.3实验动物给药后的肿瘤重量及瘤重抑制率的结果94结论115结束语11参考文献12附录13前言1.1研究背景所谓癌症就是所有恶性肿瘤的总称，然而肿瘤细胞的特性就是无限制地增生，消耗患者体内的营养。它可以破坏相邻好的细胞和组织，使人体产生各种症状，并且可以在全身各处转移和生长繁殖，可以导致发热、食欲不良以及各种脏器功能受到严重损伤等。然而随着我们的生活方式和环境的改变，癌症的发病率有着逐渐上升的趋势。虽然现在的医疗发展不断的提高，但是癌症的治疗效果还是没有到达理想的程度。目前结肠癌(Colorectalcancer,CRC)是人类高发的恶性肿瘤也是最常见的消化道肿瘤之一，每年全球约有120万新病例，预估计60万人左右死于此疾病。它的发病率一直在上升，在全部的恶性肿瘤发病率中已经到了第三位,它的死亡率现居于恶性肿瘤死因的第二位.而其发病情况有显著的地区差异，高发区主要集中在北美等发达国家。我国虽然仍处于低发病地区，但癌症的死亡率已经居于的第五位,严重危害了人类的健康。近几年来，随着经济的发展和人们的生活方式的改变，尤其是饮食结构的改变，结肠癌已成为我国发展最快上升率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁着我们国家人们的生命健康。1.2研究现状结肠癌发病率还随着年龄的增大而逐步的上升，据国内统计，以40-50岁居多，40岁以下约占1/3。高发国家的结肠癌高发年龄为60-70岁，30岁以下约占6%左右。我国结肠癌发病年龄比国外早了10-15岁左右。全世界每年新发病例约有120万，死于此疾病的人大约60万左右。中国医学科学院-肿瘤医院/国家癌症中心发布2015中国癌症统计数据显示，中国的结直肠癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤中的前5位，其中新发37.6万病例，死亡19.1万病例，已经成为非常严重危害我国人民健康的疾病。虽然科学正在不断的发展，医疗水平也在不断的提高，直肠癌的治疗水平也有明显的提高，但是对于晚期直肠癌的治疗仍不理想。直肠癌晚期治疗取得理想疗效的关键是选择正确的治疗方案，并且需要及时有效地进行治疗。然而，直肠癌的早期诊断率就比较的高，对于放疗和化疗也比较的敏感，所以会比其他癌症的治疗效果好。尤其近些年，随着各种技术不断的改进，各种治疗直肠癌的方法有了翻天覆地的提高，根据癌症援助中心（英国迈克米蓝）1971-2011年统计显示，各类癌症患者在确诊之后平均存活时间都有延长，其中结肠癌存活的时间平均从7个月延长到了10年左右，大约延长5倍。1.3研究目的和意义引发结肠癌的原因是和生活方式、遗传、饮食、环境等因素密切相关，并且结肠癌的产生涉及原癌基因、抑癌基因等多种癌症基因的过程，最终结果就是几种癌症基因相互协同作用。当抑癌基因和癌基因两者的平衡被打破时,癌症基因被细胞增殖所控制时会持续或者过度表达，同时这些抑制癌症的基因在失活或者不表达的时候，就会让癌变细胞产生逃避机体控制的免疫机制，这样就会逐渐的形成肿瘤，最后导致细胞转移和恶化。结肠癌转移相关基因的激活可能与转移抑制基因的失活有关。这是多种转移机制基因和转移相关基因共同协助作用下的最终结果。结肠癌动物模型对研究结肠癌的发生、发展及治疗等方面，具有非常重要的作用。目前人体之外的实验研究相关结肠癌的特性或者探讨治疗方法，主要还是借助已经成功建立的结肠癌传代细胞株或者动物模型。特别是在研究结肠癌相关辅助治疗方面，动物模型甚至比细胞株更加具有优势，它更加真实地反映出体内治疗的效果，对于推到临床应用具有更高的参考价值。国内外的学者对结肠癌的动物模型都做了相关研究。本文以结肠癌COLO205细胞株构建皮下移植瘤模型，研究测试药物对体内抗肿瘤的药效作用。为研究结肠癌治疗的相关科研人员提供一些理论依据。2材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物动物品系为BALB/cnude小鼠，雌性，4-5周龄16-20g，数量：56只，入组小鼠为48只。考虑到此模型成瘤的均一性较差,需要准备30%的备用动物以确保实验质量。动物均无携带特定病原，无给药史。实验动物提供商：上海灵畅生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2019-0005。动物每笼4只(同一给药组)，放入SPF级动物房内。实验用小鼠可无限量获取专用鼠粮(经辐照消毒，江苏省协同医药生物工程有限公司，中国)。整个实验期间，实验用小鼠无限量获取经处理的饮用水（酸化水），处理方式为市政供水经Mol超纯水机进行过滤并用盐酸将其pH值调节为2.0-3.0。在可预见范围内，动物食物和饮用水中的已知污染物含量不会对本实验的目的或操作过程造成影响。2.1.2仪器设备离心机（ThermoFisherlegendMACH1.6/）、倒置显微镜（TS100）、生物安全柜（ThermoMSC-Advantage）、CO2培养箱（ThermoHERAcell150）、水浴锅（DK-8B）、液氮罐（ThermoLOCATOR4）、移液器（电动）（IBSPIPETBOYacu）、移液器（1ml、200µl、10µl）（GilsonP1000、GilsonP200、GilsonP10）、麻醉剂（MATRXVIP3000）、天平（DENVERINSTRUMENTTP-602）、游标卡尺（mitutoyoCD-15cX）2.1.3试剂RPMI-1640培养基（Corningcellgro，批号：10-040-CVR）、胎牛血清（FBS）（GIBCO，批号：10270-106）、青链霉素（P.S.）（GIBCO，批号：15140-122）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（GIBCO，批号：25200-072）、PBS（Corningcellgro、21-040-CVR）2.2实验方法2.2.1细胞培养和接种以RPMI-1640培养基添加10%FBS培养于含5%CO2的37˚C培养箱。细胞连续培养，确保十代之前的任意一代接种于56只小鼠（8只备用），每只小鼠接种约5x106的COLO205细胞，接种体积为100uL，接种部位为小鼠背部右边靠近腋下。接种前用3-4%异氟烷将小鼠麻醉。2.2.2动物分组和给药方法当肿瘤生长到平均约100-150mm3左右时，48只肿瘤大小合适的小鼠根据肿瘤大小和体重被随机分成6组，每组8只。分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如表1所示：表1.分组和给药方案组别Na受试物剂量(mg/kg)b给药途径d给药周期给药次数c18PBS-i.p.两天一次14285-氟尿嘧啶30i.p.两天一次1438测试药10i.p.两天一次14485-氟尿嘧啶+测试药30+15i.p.两天一次14585-氟尿嘧啶+测试药30+10i.p.两天一次14685-氟尿嘧啶+测试药30+5i.p.两天一次14注：a：每组动物只数。b：给药体积依实验动物体重按10μL/g计算。c：实际给药次数14次，给药周期为四周。d：i.p.指腹腔注射。2.2.3动物观察每天观察每只小鼠的外观及行为，自给药开始根据实验结果连续观察4周。所有非正常的外观形态和行为活动都记录在临床观察表内。测试药有可能对动物消化系统有影响；如动物出现拉肚子，需记录。2.2.4检测指标肿瘤体积：对于皮下移植瘤模型，分组后每周两次测量肿瘤体积和体重。肿瘤体积（V）的计算方法如下：V=（长×宽2）/2。动物体重：对于皮下移植瘤模型，接种、分组（首次给药前）、给药期间每周测量并记录老鼠体重两次。动物发生意外死亡或濒死安乐死时也称重。动物状态观察：观察内容包括但不限于肿瘤结节破溃情况、动物精神状态、饮食情况等。相对肿瘤抑制率（TGI）：TGI%=（1-T/C）×100%。其中T和C分别为试验组和空白对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积（RTV），T/C%为相对肿瘤增殖率，即在某一时间点试验组与空白对照组的相对肿瘤体积（RTV）的百分比值。计算公式如下：T/C%=TRTV/CRTV×100%（TRTV：试验组平均RTV；CRTV：溶剂对照组平均RTV；RTV=Vt/V0，V0为分组时该动物的瘤体积，Vt为治疗后该动物的瘤体积）。瘤重抑制率IRTW%=（阴性对照组平均瘤重–治疗组平均瘤重）/阴性对照组平均瘤重×100%。疗效评价标准：如果TGI<60%，为无效；如果TGI≥60%，且经统计学处理试验组RTV值显著低于空白对照组RTV（p<0.05）为有效，即测试药对肿瘤生长具有显著抑制作用。2.2.5实验停药和恢复给药标准在实验过程中，小鼠体重下降≥15%时，即停止给药，停药期应足够长让小鼠恢复体重。仅体重下降≥15%的小鼠停药，其余小鼠正常给药；停药时小鼠体重恢复参照以下标准将继续实验：体重下降≤10%。2.2.6实验动物人道终点在实验过程中，若出现以下任何一项或多项情况时，应当对动物实施安乐死：1.当单只动物荷瘤体积超过2000mm3；2.肿瘤发生溃疡、坏死或感染；3.动物出现行动异常，或瘫痪；4.动物体重一旦降低超过开始给药时体重的20%。2.2.7实验结束后安乐死及实验终点实验过程中当某组中动物的平均肿瘤体积超过2000mm3或实验结束时，对动物进行安乐死处理。体内实验结束后，所有荷瘤小鼠用CO2窒息，然后脱颈椎处死。实验结束时，所有荷瘤动物拍照，将所有肿瘤取出，称重并拍照。照片见附录2和3。2.2.8统计分析结果将以平均值±S.E.M的方式呈现。两组间比较将用Dunnett’smulti-comparisontest进行检验。如果p<0.05则认为有统计学显著性差异。3实验结果与讨论3.1测试药对实验动物的反应和体重变化实验过程中动物精神状态良好，动物体重轻微下降，与同期对照组相比，G2阳性药5-氟尿嘧啶组动物体重在Day24~Day28期间相对较高，且有显著差异；G45-氟尿嘧啶+测试药高剂量组动物体重在Day17~Day28期间相对较高，且有显著差异（p<0.05）；G55-氟尿嘧啶+测试药中剂量组和G65-氟尿嘧啶+测试药低剂量组动物体重在Day21~Day28期间相对较高，且有显著差异（p<0.05）。本次实验从结果来看各组裸鼠都未见死亡。（见表2和图1）。表2.各组动物体重（g）分组分组后天数（天）037101417212428G1PBSMean19.4118.8016.8218.0317.2016.7316.9716.5715.74S.E.M.0.540.550.860.610.630.540.560.600.50G25-氟尿嘧啶Mean18.7817.5716.1116.9817.1117.8018.6718.8018.53S.E.M.0.640.660.620.770.9021.06P值0.99920.77570.99800.95780.99430.36320.08010.02710.0073G3测试药Mean19.2918.9017.9518.3117.8217.0817.3517.1616.83S.E.M.0.390.530.780.720.840.880.890.970.98P值0.99991.00000.68710.99890.96870.99730.99470.96470.7135G45-氟尿嘧啶+测试药(高)Mean19.1917.7516.9917.1318.4519.8320.9321.1720.66S.E.M.0.570.560.610.760.660.590.500.520.48P值1.00000.73600.99820.96400.57420.03450.00350.00060.0002G55-氟尿嘧啶+测试药(中)Mean18.9517.3616.0316.3417.1418.5920.1520.9220.27S.E.M.0.740.750.720.870.850.670.550.530.44P值0.99170.35960.88570.42951.00000.25380.01310.00040.0003G45-氟尿嘧啶+测试药(低)Mean19.2718.0917.5818.0918.9719.2719.8019.8519.34S.E.M.0.270.330.520.490.600.620.500.490.72P值0.99980.85990.90821.00000.34160.08420.03170.01020.0041图1.给药后各组动物体重变化趋势图3.2测试药对肿瘤体积、相对肿瘤体积及相对肿瘤抑制率的影响变化实验期间，G1空白对照组小鼠的肿瘤体积持续增长（见图2），Day0瘤体积均值为210.30±24.91mm3，Day28瘤体积均值达到1355.56±117.46mm3（见表3），RTV均值升至7.05±0.93（见图3和表4），说明人结肠癌细胞COLO205皮下移植瘤模型在本实验中成功建立。G2阳性药5-氟尿嘧啶组动物Day0瘤体积均值为199.09±23.41mm3，给药后瘤体积增长相对缓慢，Day28观察结束时瘤体积均值为475.66±175.24mm3，RTV均值升至2.03±0.51。与同期空白对照组相比，瘤体积在Day17~Day28期间相对较低，有显著差异（p<0.05，见表3）。G3测试药组动物Day0瘤体积均值为194.93±26.56mm3，给药后瘤体积增长相对缓慢，Day28观察结束时瘤体积均值为1344.84±95.93mm3，RTV均值升至7.62±1.02。与同期溶媒对照组相比，瘤体积相近，没有显著差异（p>0.05，见表3）。G45-氟尿嘧啶+测试药高剂量组动物Day0瘤体积均值为194.64±21.03mm3，给药后瘤体积增长相对缓慢，Day28观察结束时瘤体积均值为35.13±12.80mm3，RTV均值升至0.20±0.09。与同期溶媒对照组相比，瘤体积在Day10~Day28期间相对较低，有显著差异（p<0.05，见表3）。G55-氟尿嘧啶+测试药中剂量组动物Day0瘤体积均值为206.70±21.21mm3，给药后瘤体积增长相对缓慢，Day28观察结束时瘤体积均值为99.86±32.55mm3，RTV均值升至0.46±0.15。与同期溶媒对照组相比，瘤体积在Day10~Day28期间相对较低，有显著差异（p<0.05，见表3）。G65-氟尿嘧啶+测试药低剂量组动物Day0瘤体积均值为201.52±27.85mm3，给药后瘤体积增长相对缓慢，Day28给药结束时瘤体积均值为513.83±118.53mm3，RTV均值升至2.28±0.50。与同期溶媒对照组相比，瘤体积在Day10~Day28期间相对较低，有显著差异（p<0.05，见表3）。本次实验的结果显示表明测试药联合5-氟尿嘧啶给药对肿瘤模型有着明显的抑制性作用。表3.各组肿瘤体积（mm3）分组分组后天数（天）037101417212428G1PBSMean210.30345.33459.91650.49770.22943.271160.201270.951355.56S.E.M.24.9135.7542.1367.1978.4987.32109.77107.06117.46G25-氟尿嘧啶Mean199.09310.64369.64424.33476.67475.25450.07459.17475.66S.E.M.23.4132.7547.92102.84133.34156.41157.76169.87175.24P值0.97890.72630.20680.09880.07080.01550.00120.00050.0004G3测试药Mean194.93296.73439.58693.84866.88953.701061.501206.741344.84S.E.M.26.5635.1348.8855.9870.2771.1682.5896.9995.93P值0.99040.75970.99650.98300.82541.00000.92410.98941.0000G45-氟尿嘧啶+测试药(高)Mean194.64297.05359.62301.76225.14129.1181.3060.9235.13S.E.M.21.0320.9241.2537.8028.3220.2112.1911.6212.80P值0.99940.88330.61290.00060.00000.00000.00000.00000.0000G55-氟尿嘧啶+测试药(中)Mean206.70313.81369.44324.94252.56181.19140.55107.7199.86S.E.M.21.2129.7025.3730.2329.2524.2624.9127.4832.55P值0.99740.89740.28700.00020.00000.00000.00000.00000.0000G65-氟尿嘧啶+测试药(低)Mean201.52305.65339.47351.90368.53389.80445.56497.33513.83S.E.M.27.8540.3340.1052.9364.6177.9197.54114.02118.53P值0.99930.87140.16460.00550.00150.00010.00010.00010.0000图2.各组动物肿瘤体积变化趋势表4.各组相对肿瘤体积（mm3）分组分组后天数037101417212428G1PBSMean1.001.672.283.313.934.785.976.647.05S.E.M.0.000.060.160.370.460.470.720.880.93G25-氟尿嘧啶Mean1.001.591.872.022.192.091.951.962.03S.E.M.0.000.080.120.270.390.470.460.500.51P值N/A0.78750.09960.01080.00680.00030.00010.00010.0001G3测试药Mean1.001.552.333.824.775.365.936.767.62S.E.M.0.000.060.150.380.480.680.720.881.02P值N/A0.66240.99880.78850.59290.93221.00001.00000.9924G45-氟尿嘧啶+测试药(高)Mean1.001.571.851.551.150.660.430.330.20S.E.M.0.000.080.100.090.070.090.070.080.09P值N/A0.82270.27940.00030.00000.00000.00000.00000.0000G55-氟尿嘧啶+测试药(中)Mean1.001.541.871.611.210.870.660.500.46S.E.M.0.000.060.05P值N/A0.79710.17750.00030.00000.00000.00000.00000.0000G65-氟尿嘧啶+测试药(低)Mean1.001.531.751.741.751.782.012.202.28S.E.M.0.000.080.070.400.460.50P值N/A0.53360.03310.00110.00030.00000.00010.00030.0003图3.各组动物相对肿瘤体积变化趋势3.3实验动物给药后的肿瘤重量及瘤重抑制率的结果实验终点时，各实验组小鼠肿瘤重量见图4和表5。与同期溶媒对照组相比，除了G3测试药组，其他各治疗组的肿瘤重量均低于G1空白对照组，有显著差异。表5.实验终点时各组肿瘤重量（g）及肿瘤抑制率分组实验终点瘤重（g）瘤重抑制率IRTW(%)G1PBSDay28Mean1.28——S.E.M.0.11G25-氟尿嘧啶Day28Mean0.4763.28%S.E.M.0.15P值0.7918G3测试药Day28Mean1.224.69%S.E.M.0.12P值0.3262G45-氟尿嘧啶+测试药(高)Day28Mean0.0496.88%S.E.M.0.02P值0.9989G55-氟尿嘧啶+测试药(中)Day28Mean0.1389.84%S.E.M.0.04P值0.6561G65-氟尿嘧啶+测试药(低)Day28Mean0.4267.19%S.E.M.0.09P值NA图4.肿瘤重量瘤重抑制率(%)：(阴性对照组平均瘤重–治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100%。各组瘤重抑制率如下：G2=(1.28-0.47)/1.28×100%=63.28%G3=(1.28-1.22)/1.28×100%=4.69%G4=(1.28-0.04)/1.28×100%=96.88%G5=(1.28-0.13)/1.28×100%=89.84%G6=(1.28-0.42)/1.28×100%=67.19%相对肿瘤增殖率(T/C%)：用于评价药物抗肿瘤活性的作用，相对肿瘤增殖率T/C(%)=治疗组(T)RTV平均值/阴性对照组(C)RTV平均值×100%。疗效评价标准：T/C(%)>40%为无效，T/C(%)≤40%，且与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)为有效。在实验过程中，各组相对肿瘤增殖率的情况见表6表6.各组相对肿瘤增殖率DaysaftertreatmentG1PBSG25-氟尿嘧啶G3测试药G45-氟尿嘧啶+测试药（高）G55-氟尿嘧啶+测试药（中）G65-氟尿嘧啶+测试药（低）MeanMeanT/C(%)MeanT/C(%)MeanT/C(%)MeanT/C(%)MeanT/C(%)Day011100.001100.001100.001100.001100.00Day31.671.5995.211.5592.811.5794.011.5492.221.5391.62Day72.281.8782.022.33102.191.8581.141.8782.021.7576.75Day103.312.0261.033.82115.411.5546.831.6148.641.7452.57Day143.932.1955.734.77121.371.1529.261.2130.791.7544.53Day174.782.0943.725.36112.130.6613.810.8718.201.7837.24Day215.971.9532.665.9399.330.437.200.6611.062.0133.67Day246.641.9629.526.76101.810.334.970.57.532.233.13Day287.052.0328.797.62108.090.202.840.466.522.2832.344结论测试药与5-氟尿嘧啶联合使用能够对本实验结肠癌移植瘤模型有较好的抑制生长作用,而且小鼠的生存能力也有所提高,增强了荷瘤小鼠的免疫功能，并且测试药联合5-氟尿嘧啶抗肿瘤的作用比较单独应用测试药作用更加的强烈。此外测试药物联合5-氟尿嘧啶给药对体重的影响比较小,对后期的实验给药非常合适。本文可以为研究治疗结肠癌相关肿瘤模型提供相关理论依据。5结束语目前，癌症的发病率和死亡率呈逐渐上升的趋势。根据美国癌症协会的估计，可能90%以上癌症患者的死亡都受到不同程度耐药性的影响，而结肠癌的研究主要集中在癌症基因的发病机制、结肠癌基因的治疗、与结肠癌相关的蛋白酶的作用等方面，结肠癌治疗的多重耐药机制和药物治疗机制等方面，已取得非常大的进展。对结肠癌未来的研究，有望在肿瘤血管、多重耐药、基因治疗等方面取得突破性进展。血管的生成是一个包括血管里面的内皮细胞激活、增殖和内皮细胞的迁移，重新形成的血管和血管网络等多方面的复杂过程。近年越来越多的研究热点是通过肿瘤血管的抑制为目的来抑制结肠癌的形成。相信有效抑制肿瘤血管形成的药物将来会成功的研发出来。肿瘤细胞的多重耐药是导致临床抗感染药物治疗、肿瘤化疗失败重要的原因之一。克服多重耐药一直是科研人员追求得目标。相信科研人员最终会克服治疗肿瘤多药耐药的难题。经过科研人员的长期努力，结肠癌的研究取得了非常大进展，但还是需要努力。相信在不久以后，人类会克服危害人类健康的结肠癌和相关问题。参考文献[1]赖跃兴,靖大道大肠癌流行因素的研究现状[J]中国肿瘤2007(05)[2]驴强,邢沈阳,赵志辉,张西臣,李建华,龚鹏涛结肠癌的研究现状及展望[J]中国实验诊断学2009.13(8),1134-1136[3]叶德敬,刘超英,张雨洁结直肠癌