培养基的制备

第二讲植物组织培养基的制备培养基的重要性:1)植物材料生长的营养来源；2)调节植物材料生长与分化的主要途径。第一节培养基的组成培养基种类比较多共同之处：含有植物生长发育所必须的营养物质和生物活性物质(激素）不同之处：配制培养基的化学试剂、培养基成分的浓度与比例不同成分培养基名称MSSHB5WPMVW大量元素(mg/L)KNO3190025002500525NH4NO31650400NH4H2PO4300Ca(NO3)2·4H2O556(NH4)2SO4134500K2SO4990MgSO4·7H2O370400250370250CaCl2·2H2O44020015096KH2PO4170170250NaH2PO4150Ca3(PO4)2200微量元素（mg/L）MSSHB5WPMVWMnSO4·H2O101022.5MnSO4·4H2O22.37.5KI0.831.00.75H3BO36.25.03.06.2ZnSO4·7H2O8.61.02.08.6CuSO4·5H2O0.0250.20.0250.25Na2MO4·2H2O0.250.10.250.25CoCl2·6H2O0.0250.10.025FeSO4·7H2O27.815.027.827.8Na2EDTA37.320.037.337.3Fe2(C4H4O6)328.0酒石酸铁有机营养（维生素和氨基酸,mg/L）MSSHB5WPVWNicotinicacid(烟酸)0.55.01.00.5Pyridoxin-HCl

(Vt-B6)0.50.51.00.5Thiamine-HCl

(Vt-B1)0.15.010.01.0myo-inositol

(肌醇)1001000100100Glycine(甘氨酸)2.02.0碳源(sugar,g/L)Sucrose蔗糖3030202020二、无机营养不同培养基的无机盐（特别是大量元素）的浓度差异很大。

16种必需元素：大量元素：C,H,O,N,P,K,Ca,Mg,S微量元素：Fe,Cl,Cu,Mo,B,Zn,Mn一、

水

要求纯净：蒸馏水、去离子水，双蒸水三、

有机营养有机营养=有机成分：维生素和氨基酸的总称。常用：肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和甘氨酸等。其它的维生素：维生素M（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙等。其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等难培养的材料，可增加有机成分的种类。

四、碳源

最常用的糖是蔗糖(sucrose)，但也有用葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)或其它的糖，有时几种糖混用。糖是营养物质，但不是越多越好。培养基中糖的用量大多在10-60g/L，一般为20-30g/L。

五、植物生长物质=植物激素植物生长物质是植物激素和植物生长调节剂的总称。植物激素：植物合成的、微量就有显著效应的物质。植物生长调节剂：人工合成的、具有植物激素相似作用的物质。根据功能不同，植物生长物质共分为五大类。1.生长素(Auxins)

吲哚乙酸(IAA)

吲哚丁酸

(IBA)

120元/1g187元/5gSigma公司α-Naphthalaeneaceticacid

(NAA)

萘乙酸(NAA)314元/25g2,4-Dichlorophenoxyacetic

acid

(2,4-D)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)除草剂240元/100g生长素的在组织培养中的主要作用：(1)

促进细胞分裂、增殖，形成愈伤组织；2,4-D>NAA>IAA,IBA(2)控制器官的分化，诱导根的形成、抑制芽的诱导。诱导根的作用：IBA>NAA>IAAZeatin

玉米素

(ZT)

（遇高温不稳定）常用2.细胞分裂素

(Cytokinins)

574元/5mg13256元/250mg番茄、杨树异戊烯基腺嘌呤:2-isopentenyladenine,2iP;遇高温不稳定1226元/1g杜鹃花6-benzylaminopurine

6-苄基氨基嘌呤（6-BA,BA,BAP）

最常用298元/1g

Kinetin激动素

（KT）

常用688元/1gThidiazuron(TDZ；噻苯隆

):

棉花脱叶剂；后发现具有强烈的细胞分裂素的作用，比BA的效果高几十-几百倍。常用730元/25mg噻苯隆细胞分裂素在植物组织培养中的主要作用：1.促进细胞分裂、增殖，形成愈伤组织；2.控制器官的分化，诱导芽的形成和增殖、抑制根的诱导。

生长素和细胞分裂素的发现和应用对于植物组织培养技术的建立起了决定性的作用。1957年：FolkeKarlSkoog和Carlos

Miller发现培养基中生长素和激动素浓度比值决定烟草愈伤组织根或芽的形成。FolkeKarlSkoog(July15,1908–February15,2001)In1962,SkoogandToshioMurashige

发表了最著名的植物组织培养基，MurashigeandSkoogmedium,MS培养基

。MurashigeTandSkoog,F.(1962)Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.PhysiolPlant18:100-127)生长素浓度细胞分裂素浓度生根生芽愈伤组织细胞分裂素/生长素的比值：高：形成芽；低：形成根；相当：愈伤组织增殖，但不分化=植物器官分化的激素调控模式——具有普遍性：在很多植物上得到证明——是进行植物组织培养技术研究最重要的指导思想。3、赤霉素

（Gibberellins）

赤霉素种类很多，有七、八十种，其中以赤霉酸3（Gibberellicacid,GA3）用得最普遍。675元/1gGA3赤霉素的生理作用赤霉素最显著的作用是促进细胞的伸长，也有打破种子休眠的作用。在植物组织培养中使用赤霉素主要用于促进芽或茎的伸长。赤霉素对热不稳定，故不能用高温法消毒。4、乙烯

CH2=CH2

乙烯促进果实成熟，加速植物衰老。植物组织培养极少使用乙烯（乙烯利），相反，而是尽量控制乙烯的产生。

5、脱落酸（Abscisicacid）

ABA

400元/100mg热不稳定促进植物的衰老，植物组织培养很少用。在胚状体（embryoid）的诱导和培养中常常使用脱落酸，促进胚状体的成熟。

七、有机附加物

（Organicadditives）

水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量为0.1-10g/L，一般为0.5-3g/L。椰子汁：100-200ml/L。这些物质的成分复杂、不明确，统称为有机附加物。当材料生长不好时，加入这些物质往往可以会明显改善材料的生长状况。

六、凝固剂琼脂（agar）是最常用的凝固剂，用量为6-12g/L。另外还有phytagel,Gelrite,4g/L。

八、其它物质

防止与减缓植物材料褐化的物质：1）抗氧化剂：抗坏血酸（Vc）、L-半光氨酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等。2）吸附剂：活性炭（无选择性）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP；酚类物质吸附剂）。

蝴蝶兰叶片的褐化山药褐化活性炭对茎段培养的影响

第二节培养基的制备

垂吊海棠

芽诱导培养基配方：MS+蔗糖30.0g/L+琼脂8.0g/L+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基配方：MS+蔗糖30.0g/L+琼脂8.0g/L+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/LMS培养基大量元素mg/L微量元素mg/LKNO31900MnSO4·4H2O22.3NH4NO31650KI0.83MgSO4·7H2O370H3BO36.2CaCl2·2H2O440ZnSO4·7H2O8.6KH2PO4170CuSO4·5H2O0.025烟酸0.5Na2MO4·2H2O0.25Vt-B60.5CoCl2·6H2O0.025Vt-B10.1FeSO4·7H2O27.8肌醇100Na2EDTA37.3甘氨酸2.0

为了便于培养基的配制，实际操作过程中可以先将常用的成分配成一定浓度的母液（stocksolution），然后在配各种试验培养基时取一定量的母液稀释。可以配成母液的是无机盐、有机成分和植物激素等。

1、无机盐母液的配制（以MS培养基为例）

1）大量元素母液的配制：大量元素浓度比较高，故母液浓度(倍数)不能过大，否则溶解不完全，容易析出(特别是冬天)，使用很不方便，一般为20、50或100倍。另一个要考虑的问题是高浓度时有些离子之间发生会发生相互作用，形成沉淀，如SO42-、PO43-和Ca2+之间。因此，在母液浓度较高时，Ca盐要与硫酸盐、磷酸盐分开。

因此，母液浓度高时MgSO4和CaCl2要分开。如把KNO3和CaCl2·2H2O配在一起（母液I），NH4NO3

、MgSO4·7H2O和KH2PO4配在一起（母液II），这样，即使母液浓度达到100倍也不会出现沉淀。

MS大量元素mg/LKNO31900NH4NO31650MgSO4·7H2O370CaCl2·2H2O440KH2PO4170以MS培养基为例:当母液浓度为20倍时，这5种盐配在一起，不会出现沉淀；但当母液浓度达到50倍时就出现沉淀。2）微量元素母液的配制：

除铁盐外，其它微量元素可以全部配在一起，浓度常为100~200倍。

Fe2+容易变成Fe3+而形成沉淀，不利于植物材料的吸收，所以把FeSO4同Na2EDTA配在一起，形成络合铁（稳定，植物利用度高）。其母液浓度为100-200倍。配法是先分别将FeSO4和Na2EDTA溶解，然后等体积混合，边混合边搅拌，混合液为黄色。微量元素母液和铁盐要放在冰箱中保存。

2.有机成分母液的配制

一种培养基的有机成分(氨基酸和维生素)可以配在一起,100-200倍。有机成分母液应放在冰箱中保存，否则容易生霉、变质。

3.植物激素母液的配制

每种植物激素要单独配一种母液，浓度为0.5-1.0mg/mL。激素不易溶于水，但易溶有机溶剂（乙醇、二甲基亚砜）和稀酸稀碱。70-90%乙醇：溶液无菌，加入培养基后pH不变。稀酸稀碱：需要过滤灭菌；加入培养基后pH会变。

激素母液也应在低温下保存。

第三节、培养基的制备

1.根据植物材料、培养目的设计好试验培养基的配方（基本培养基，糖、植物激素、琼脂和其它成分的浓度），并且要准确无误的写在实验记录本上2.根据培养基的体积和母液浓度，求出各种成分的用量3.根据计算出来的结果，配成各种培养基诱导垂吊海棠叶片形成不定芽培养基：MS+蔗糖30.0g/L+琼脂8.0g/L+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L，pH值5.8，体积1500ml。其操作步骤如下：1、计算出各种成分的用量，填写培养基记录表2、配制过程

（1）

称好30.0g蔗糖和8.0g琼脂，放入搪瓷量杯或其它金属容器中，加600ml左右（总体积的2/3）蒸馏水，加热、煮沸5min，至琼脂完全熔化；（2）

按量加入各种成分，然后用蒸馏水定容至1500ml；(在记录表上打钩，防止漏加、多加)（3）

用KOH或NaOH和HCl调pH值至5.8。非常重要，pH值不仅影响琼脂培养基的凝固效果，而且也影响培养基中营养成分的有效性和植物材料的生长状况（不同植物材料有不同的最佳pH环境，水稻、杜鹃花、兰花等喜欢偏酸性）。（4）

分装到培养容器中，容器盛培养基量为容器体积的1/5-1/3，但不要超过2/3，容器封口。3、培养基的消毒

培养基做好以后，要及时消毒，否则容易滋生细菌和真菌。这不仅会改变培养基的成分，而且菌物还会产生有毒的物质。培养基的消毒方法有如下几种：

1）

高温灭菌法：简单、易行；一次可以灭菌大量的培养基，最常用。所用的温度是121℃，压力是1.1—1.2大气压。高温消毒时应注意的问题：一定要先排气10min，否则不能消毒不彻底；高温消毒后，培养基的pH值会下降0.2—0.5个pH单位；高温消毒过程中，培养基中有些物质会被破坏或发生沉淀。如蔗糖会水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖变成葡萄糖酸等；有些物质甚至几乎完全被破坏，如赤霉素、玉米素等。物质破坏程度与消毒时间和压力有关。

培养基体积与消毒时间的关系

培养基体积（ml）

消毒时间（min）

20-50

20（121℃）

50-500

25（121℃）

500-5000

35（121℃）

空试管、空瓶，培养皿、滤纸等用具

30（130℃）

2)过滤灭菌法过滤消毒不会破坏培养基的成分和改变培养基的pH值，所以在原生质体和单细胞培养时要用过滤消毒法对培养基进行灭菌。热不稳定的物质，如ZT、2ip、GA3、核黄素等，也要用过滤消毒法灭菌

无菌微孔滤膜：孔径0.2-0.45

m，比微生物及其孢子直径小过滤灭菌的操作：

先将微孔滤膜（孔径0.2-0.45

m，用前最好在蒸馏水中浸泡数