原发性舍格伦综合征患者lr7、8、9表达及lr7、9在腮腺组织中的表达

原发性舍格伦综合征患者lr7、8、9表达及lr7、9在腮腺组织中的表达

shjgreen’ssyndrose，简称sjsyndrose，是一种自身免疫性疾病，其特点是外源性腺体的破坏，口腔粘膜和眼睛粘膜干燥，并伴有各种自身免疫性疾病。可分为原发性舍格伦综合征(primarySj觟gren’ssyndrome,pSS)和继发性SS(secondarySj觟gren’ssyndrome,sSS)。病变局限于泪腺和唾液腺者,称为pSS;同时伴有其他自身免疫性疾病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等,则称为继发性SS。在自身免疫性疾病中,pSS的发病率仅次于类风湿性关节炎,其在正常人群中的发病率为0.6%,男女之比为1∶9,好发于中老年女性。与其他自身免疫疾病如类风湿关节炎和系统性红斑狼疮相比,舍格伦综合征是一个进展缓慢,预后较好的疾病。但SS最常见的症状口干和眼干严重影响了患者的生活质量。类似于其他自身免疫性疾病,SS的病因尚不明确。研究认为,病毒、激素、遗传和环境因素与SS的发病和进展有关。一些病毒如Epstein-Barr病毒、柯萨奇病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和反转录病毒等都被认为可能是SS的诱因。小唇腺的基因芯片研究显示,干扰素诱导基因如Toll-likereceptor(TLR)家族,干扰素诱导跨膜蛋白家族的3个成员IFITM1、IFITM2和IFITM3,干扰素调节因子1(IRF1)、干扰素刺激转录因子3γ(ISGF3G)(也称为IRF9)和干扰素α诱导蛋白27(I-FI27)等在pSS中显著高表达。由于TLRs在先天性免疫和获得性免疫应答中都是一个重要的调节因子,所以TLR家族成员在免疫科学领域是一个研究热点。TLRs在宿主和病原微生物的接触面发挥作用,作为人类第一道防御监视系统,能在第一时间抵抗病原物的侵袭。TLRs能发现病原相关分子模式(PAMPs),而后者是病原体的一类保守的结构特点,被激活后即被先天性免疫系统识别。迄今为止,已发现了13种TLRs:TLR1~9系人类和小鼠共有,TLR10仅在人类发现,TLR11~13仅在小鼠发现。一些TLRs(1、2、4、5和6)存在于细胞表面,而另一些TLRs(3、7、8和9)局限于细胞内。TLR7和TLR8作为家族中最相似的成员,能识别病毒的PAMPs,TLR9能被含有非甲基化的CpG二核苷酸的病毒DNA序列激活。所以,TLR7、8和9组成了TLR家族中的一个功能亚族,它们能在内涵体或溶酶体内识别病毒的PAMPs。由于多种病毒被认为是pSS发病的诱因,故本研究通过使用实时多聚酶链反应(real-timePCR)分析pSS患者外周血中TLR7、8、9的表达水平,并对TLR7和TLR9在pSS患者腮腺组织中的表达进行了检测。1材料和方法1.1pss的诊断研究对象来自2006年2月~2006年8月在我院口腔颌面外科涎腺专科门诊就诊的病例,共61例。参考2002年欧美诊断标准,其中pSS37例,对照组24例为非pSS的口干患者。pSS具体诊断标准:(1)口干症状;(2)眼干症状;(3)口干体征———方糖试验30min内未融化;(4)眼干体征———施墨试验≤5mm/5min;(5)组织病理学———唇腺活检至少有1个淋巴细胞浸润灶;(6)血清学检查———类风湿因子、抗SS-A、抗SS-B抗体至少1项阳性;(7)无类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病等其他自身免疫性疾病。根据以上诊断标准,将61例患者分为pSS组和对照组。pSS组37例患者以上6项中(5)、(6)均为阳性,而其余4项中2项为阳性。对照组24例患者仅有口干症状或腮腺肿大症状,而无其他任何诊断为pSS的客观症状和实验室检查结果。对照组包括非pSS口干患者(如老年性口干、服用降血压、安眠药后造成的口干等)和慢性腮腺炎患者。pSS组37例,男1例,女36例;年龄21~73岁,平均(47.38±12.27)岁。对照组24例,男1例,女23例;年龄23~65岁,平均(48.13±11.32)岁。1.2免疫组化测定GeneAmpPCRSystem9700(美国ABI公司);GeneAmpPCRSystem2400(美国ABI公司);核酸蛋白质定量系统DV800(美国BeckmanCoulter公司);ABIPRISM7900HT(美国ABI公司);人白血病T淋巴(Jurkat)细胞株(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所);免疫荧光一抗TLR7:sc-30004是兔抗人的多克隆抗体(SantCruzBiotechnologyCalifornia,美国);免疫荧光二抗sc-2012是Cy3羊抗兔的IgG(SantCruzBiotechnology,California,美国);免疫组化一抗TLR9:sc-16247是兔抗人的多克隆抗体(SantCruzBiotechnology,California,美国);免疫组化二抗HRP-Polymer-Goatanti-rabbitIgG,即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);激光共聚焦显微镜(LeicaTCSSP2,德国)。1.3红细胞裂解及体外感官检测(1)每位患者采集外周静脉血2.5mL,以0.5mL枸橼酸(ACD)抗凝剂(枸橼酸0.48g、枸橼酸钠1.32g、右旋葡萄糖1.47g加蒸馏水至100mL)进行抗凝处理;将采集到的血液静置约30min后,3000r/min离心2min,分离血浆。吸出血浆后,按1︰4~5的比例加入红细胞裂解液,用漩涡振荡器混合均匀,放于4℃环境下10min,以裂解红细胞;2000r/min离心10min,弃上清。按每毫升全血加入1mLRIzolRNA保存液加入保存液,以备RNA抽提。(2)pSS组3例患者,对照组3例患者因药物或保守治疗无效,在患者的要求下进行腮腺浅叶切除术(pSS组为类肿瘤型SS,对照组为重度慢性阻塞性腮腺炎)。全麻下取腮腺组织,经中性甲醛溶液固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,做4μm厚连续切片,备TLR7免疫荧光和TLR9免疫组化检测。1.4实验方法1.4.1.4离心稳定性检测温育(15℃~30℃)5min,以完全分离核蛋白;加入0.2mL氯仿,剧摇15s,温育(15℃~30℃)3min,13200r/min、4℃离心15min;将离心后的上层水相吸出,转移到新管中,加入0.5mL异丙醇,混匀,室温下温育10min,13200r/min、4℃离心10min后,弃上清;在沉淀中加入1mL焦碳酸二乙酯和75%乙醇,振荡混匀,9000r/min、4℃离心5min,弃上清;加入30μL无RNase水,吹打混匀后进行微离心;取1μL上述液体,1∶100稀释,用核酸蛋白质定量系统测该溶液的OD值,以检验所抽提的RNA质量和含量。-70℃冷冻备用。1.4.2pcr反应(1)配制PCR试剂混合溶液(2)将Mix1分装入PCR管中,每管3.5μL,加入经过离心的RNA2.5μL,混匀,离心。用PCR仪在65℃反应5min,于冰上快速冷冻。(3)离心后,各管中再加入Mix23.5μL,混匀后离心,42℃反应2min。(4)在每管中加入0.5μL反转录酶,进行PCR反应。采用两步法,反应条件如下:(5)取1mL完成反转录反应的溶液进行1∶100稀释,测试OD值。1.4.3jurkat细胞浓度用全培养液(PRMI1640,L-谷氨酰胺,50mmol/LHEPES,100U/mL青、链霉素,10%胎牛血清)稀释Jurkat细胞浓度为(1~5)×106/mL,37℃,5%CO2条件下孵育,2~3天换液1次,取对数生长期细胞,收集计数达1×107/mL。按每106~107个细胞/mLTRIzol加入试剂,并按前述方法进行总RNA抽提,反转录为cDNA。1.4.4引物的设计与制作具体步骤如下。(2)以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照基因,以PrimerExpress5.0软件设计扩增模板的引物。设计的引物如下:(4)引物稀释:引物在稀释前,需至少离心1min,按说明书计算,以确定稀释引物所需要加入蒸馏水的量,配成100μmol/L的储存浓度,用前配制成10μmol/L的工作浓度。(5)引物检测:要求引物的溶解曲线为单峰,引物无二聚体产生。1.4.5ct值的标化PCR反应结束后,确定基线范围(一般为3~15个循环),分析各孔CT阈值(阈值=基线信号的标准偏差×10)。为消除每份样品的浓度不一致与每块板之间条件操作因素差异所形成的误差,需要对所获得的原始CT值进行标化。本研究用管家基因GAPDH作为内参,1∶32稀释jurkat细胞的IRFs表达量为标化样品,比较各样本表达量的高低。以SDS2.1软件分析其Ct值。-△△Ct值=-[(样本原始Ct值-样本GAPDH的Ct值)-(Jurkat原始Ct值-JurkatGAPDH的Ct值)]-△△Ct值越高,表明样本中IFN-α基因的起始模板量越大。实时定量PCR共40个循环,每个循环包括95℃、10s,95℃、5s和60℃、30s。1.4.6免疫荧光二抗pbs腮腺组织切片与1∶50稀释的抗TLR7一抗在4℃潮湿环境下孵育。然后再与免疫荧光二抗在37℃环境下孵育30min。以PBS替代一抗作为阴性对照。以细胞上出现红色为阳性标记。1.4.7ntm二步法免疫组织化学检测采用MaxVisionTM二步法,具体操作参考试剂盒工作手册。以PBS替代一抗作为阴性对照,以细胞质或细胞膜上出现棕黄色颗粒作为阳性标记。1.5统计处理应用SAS6.12软件包对血细胞中的-△△Ct值进行t检验。P<0.05为组间有显著性差异。2结果2.1组tlr7mrna表达量的比较37例pSS组TLR7mRNA的-△△Ct值为6.87±1.29,24例对照组TLR7mRNA为5.75±1.05(-△△Ct值越高,表明样本中TLR7基因的起始模板量越大)。pSS组的TLR7mRNA表达量显著高于对照组,2组之间有显著差异,P=0.0008。pSS组TLR7是对照组的2.17倍(图1A、图2)。2.2组tlr8mrna表达量的比较37例pSS组TLR8mRNA的-△△Ct值为8.62±1.89,24例对照组TLR8mRNA为9.18±1.46。2组的TLR8mRNA表达量无显著差异,P=0.223。pSS组TLR8是对照组的0.68倍(图1B、图2)。2.3tlr9mrna表达量37例pSS组TLR9mRNA的-△△Ct值为7.60±1.69,24例对照组TLR9mRNA为6.38±1.42。pSS组的TLR9mRNA表达量显著高于对照组,2组之间有显著差异,P=0.0047。pSS组TLR9是对照组的2.33倍(图1C、图2)。2.4tlr7在腺泡细胞中的表达免疫荧光检测发现,pSS组3例患者TLR7阳性表达的细胞位于导管上皮细胞、淋巴细胞和上皮岛(图3A~D)。对照组3例TLR7阳性表达的细胞局限于导管上皮细胞,淋巴细胞为阴性表达(图3E)。TLR7在2组腺泡细胞中的表达均为阴性。pSS组与对照组的最大差别是SS组淋巴细胞阳性表达和上皮岛阳性表达。由于上皮岛是pSS组织病理学的一个特征,所以两者间的关系有待于进一步研究。2.5tlr9在腺泡细胞表达免疫组化检测发现,pSS组3例患者TLR9阳性表达的细胞位于导管上皮细胞、淋巴细胞和上皮岛(图4A~D)。对照组3例TLR9阳性表达的细胞局限于导管上皮细胞,淋巴细胞为阴性表达(图4E)。TLR9在2组腺泡细胞中的表达均为阴性。与TLR7一样,pSS组与对照组的最大差别是pSS组淋巴细胞阳性表达和上皮岛阳性表达。3tlr3、7,8和9在pss和h-的表达方面的作用,主要表现为TLR表达于多种细胞,如呼吸道和消化道上皮细胞、B细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞(DCs)、调节T细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和内皮细胞。TLR表达于多种细胞,证实其在先天性和获得性免疫应答中的重要作用。TLR的一个显著特征是对分子序列和化学结构多样性和专一性的识别。研究发现,树突状细胞在pSS发病中具有重要作用。通过TLR受体激活浆细胞样树突状细胞,将先天性免疫和获得性免疫连接起来,诱导I型IFN(IFN-α/IFN-β)分泌显著增多。而在血液中,I型干扰素主要来源于浆细胞样树突状细胞,这类细胞被激活后能产生大量I型干扰素,激发先天性和获得性免疫应答的发生。在pSS,血液中的浆细胞样树突状细胞的相对数量显著下降,而剩余的浆细胞样树突状细胞仍能被激活,并产生大量的I型干扰素。通过TLR激活,导致浆细胞样树突状细胞分泌IFN-α,主要是由于病毒感染。多种TLRs能识别病毒的组成部分,包括TLR3、7、8和9。浆细胞样树突状细胞强烈表达TLR7和TLR9,如被TLR7配体、单链病毒RNA和一些TLR9的激活物(如DNA病毒和含有磷酸胞苷酰CpG的寡核苷酸)激活,能产生大量的IFN-α。浆细胞样树突状细胞分泌大量的IFN-α,而浆细胞样树突状细胞又主要表达TLR7和9,这从另一方面说明TLR7和9的配体是体内IFN-α产生的主要诱导剂。各种不同类型细胞在应对外界刺激,包括细菌、异物、大分子、其他化学合成物和病毒等时产生的一类蛋白质,称为干扰素(IFN)。病毒感染在IFN产生的初期起着重要作用,但在组织水平的持续的IFN-α合成,需要含有RNA的免疫复合物激活浆细胞样树突状细胞,产生IFN-α。I型IFN能召集其他免疫细胞,通过I型干扰素的各种免疫功能维持免疫应答。浆细胞样树突状细胞产生的IFN-α能召集其他活化的细胞进入pSS的目标脏器,提示TLR7或TLR9可能在pSS发病过程中发挥一定作用。除识别病原体外,TLRs也能识别宿主坏死组织释放的自身抗原。SS的特征是淋巴细胞浸润外分泌腺,导致外分泌腺功能受损,临床表现为口干和干燥性角结膜炎。淋巴细胞浸润灶中的细胞大多数是T淋巴细胞,B淋巴细胞占20%~30%,巨噬细胞较少。大约70%的T细