CCAA团体标准草案编制说明-杯状病毒

CCAA团体标准草案编制说明基本信息标准草案名称中文水体中杯状病毒检测方法实时荧光RT-PCR法英文Amethodfordeterminationofcalicivirusinwater---real-timeRT-PCR项目类型√制定□修订（被修订标准名称及编号：）计划编号2022TB036起止时间2022年11月---2023年10月标准起草单位北京美正生物科技有限公司、中华人民共和国大连海关、中国合格评定国家认可中心、本溪市动物疫病预防控制中心、拱北海关技术中心、浙江诺威检测认证有限公司、国检测试控股集团辽宁有限公司。起草组成员刘磊、徐娜、白庆华、王志强、姚丽锋、周傲白雪、麻丽丹、陶文靖、盛琳、陆嘉诚、崔亚丽、杨希国、李丽、刘石鑫。项目调整情况无背景、目的和意义背景水体的安全问题目前已经受到了人们的广泛关注，肠道病毒的水源性爆发是一项重大的公共卫生问题，例如人们生活中的饮用水、食品生产加工用水、水产养殖用水、污水等，这些水如果受到病毒污染，则会给人们的健康带来极大危害。肠道病毒来源广，传播途径多样，其中杯状病毒的环境适应能力强，能在自然环境水体中存活很长时间，是对人类健康影响较大的污染物，已经导致了多起大规模的疾病爆发，引起了人们的广泛关注。杯状病毒科（Caliciviridae）为无囊膜的单股正链RNA病毒，包含许多对人类和动物健康带来严重威胁的病毒成员。其中五个病毒属是由感染哺乳动物的病毒所组成，包括水疱性病毒属（Vesivirus）、兔病毒属（Lagovirus）、杯状病毒属（Norovirus）、札幌病毒属（Sapovirus）、内博病毒属（Nebovirus）。杯状病毒是引起儿童和成人非细菌性胃肠炎的主要病原之一，常在医院、餐馆、学校、托儿所、孤儿院、养老院、军队、家庭及其他人群中引起暴发。其中杯状病毒流行大多源于某种食物或水的污染，再因人传人而发展，故预防措施需全面着手。目前，杯状病毒主要的检验方法为电镜法、免疫法、PCR法，其中PCR方法为主流方法，但由于环境样本中病毒含量非常低，病毒的检测非常困难，鉴于此，需要提高杯状病毒的富集效果以及检测的灵敏度和准确度，建立一种简便易操作的水体中杯状病毒检测方法，对水体中杯状病毒污染水平实现有效监控。目的本标准建立“水体中杯状病毒检测方法实时荧光RT-PCR法”体系，包括采用阳离子膜富集小体积水和超滤方法及装置对大体积水富集回收操作，以及杯状病毒实时荧光RT-PCR法。意义通过制定此项标准填补我国标准上的空白，为水体中杯状病毒的富集和检测提供前沿、高效方法。工作简况标准主要起草人任务分工刘磊、徐娜、白庆华、王志强、姚丽锋、周傲白雪、麻丽丹、陶文靖：对方法涉及的仪器、耗材、试剂等要求给出明确规定；对病毒富集及检测操作流程（浓缩、洗脱、核酸提取、检测等）给出明确规定；病毒富集、RT-PCR反应涉及的参数给出明确规定；对实时荧光RT-PCR结果判读和分析给出明确规定；起草标准文本。盛琳、陆嘉诚、崔亚丽、杨希国、李丽、刘石鑫：方法实验室内验证和重复性实验。主要工作过程1.分工情况标准起草组织工作由北京美正生物科技有限公司牵头负责，主要工作为收集整理国内外相关标准和技术资料；制定方法验证方案、负责检测方法优化建立与验证、样品检验结果分析；组织标准起草及实验室方法可行性验证，撰写标准文本和编制说明。2.起草阶段2022.11-2023.10：方法验证和起草征求意见稿；3.征求意见阶段2023.11：征集意见和制定标准文本；4.标准审定阶段2023.12：标准评审和报送材料。标准编制原则和确定标准主要内容的论据标准编制原则本标准为首次制定，以科学的实验数据为依据，经过科学研究而制定。本标准旨在利用实时荧光RT-PCR法实现水体中杯状病毒的快速定性检测。本标准不仅是SN/T4784-2017《出口食品中杯状病毒和甲肝病毒检测方法实时RT-PCR方法

》和DB45/T2138-2020《水体中杯状病毒的核酸检测方法实时荧光RT-PCR法》的有效补充，同时对其进行了改进。在简化水样病毒富集处理的同时，保证了测试的准确性与可重复性，能快速测定水体中的杯状病毒，提供了一种准确快速的检测方法，具有广泛的适用性。同时，本方法在编制过程中引入第三方实验室对本标准所列方法进行验证和评价，具有先进性、科学性、合理性和可操作性。确定标准主要内容的论据标准主要内容包括两部分，一部分为水体中杯状病毒检测，需要验证方法的检出限和重复性；另外一部分需要验证CS1000plus水体自动采样富集一体机用于水体中MS2过程控制病毒的浓缩富集回收效果，从而验证在水体样品检测杯状病毒中应用的适用性，包括MS2的标准曲线的制备，MS2添加到不同水体样品中的回收率。1、方法的检出限每份样本加入50μL杯状病毒质控品的稀释液,相当于300基因拷贝/500mL瓶装水样本,结果见下表1。表1水中杯状病毒的检出限样品编号杯状病毒加入量（基因拷贝/500mL瓶装水样本）Ct值结果判定130038.667阳性230037.804阳性330038.237阳性430040.419阴性530038.074阳性630039.058阳性730038.112阳性830037.567阳性930038.091阳性1030038.453阳性方法的重复性验证制备样本阴性样本：不添加任何杯状病毒的水样本。高水平添加样本：500mL水样品中加入600个基因拷贝的杯状病毒（每份样本加入100μL杯状病毒质控品的一万倍稀释液,相当于600个基因拷贝/500mL瓶装水样本）。验证结果见下表2。表2水中杯状病毒检测方法的重复性（30个样品）样本分组样本编号添加水平（基因拷贝/500mL）Ct值结果判定第一组110/阴性1230038.12阳性1360037.04阳性第二组140/1530037.98阳性1660035.65阳性第三组170/阴性1830038.65阳性1960036.34阳性第四组200/阴性2130039.22阳性2260035.87阳性第五组230/阴性24300/阴性2560037.02阳性第六组260/阴性2730038.53阳性2860036.98阳性第七组290/阴性30300/阴性3160036.55阳性第八组320/阴性3330037.80阳性3460036.23阳性第九组350/阴性3630038.05阳性3760036.76阳性第十组380/阴性39300/阴性4060035.33阳性水体自动采样富集一体机富集水体样本中MS2适用性及回收率验证MS2标准曲线制备结果见下表3表3方法的标准曲线浓度MS2原液MS2101×稀释液MS2102×稀释液MS2103×稀释液MS2104×稀释液Ct值22.54325.69729.32232.89136.863标准曲线y=-3.5834x+22.296相关系数r＝-0.9994水体样本中MS2回收率验证实验取10μLMS2添加到不同的水体样品中，每种类水体样品做10个样本。饮用瓶装水中MS2的回收率实验见下表4表4饮用瓶装水样本MS2的回收率实验（10个样品）样品名称MS2本底值MS2添加量MS2实测值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相对标准偏差RSD%瓶装水010μL30.95530.67%32.00%16.72%30.89631.85%31.17826.57%31.09827.97%30.96530.47%30.49041.35%31.31624.32%30.89531.87%30.68436.50%30.60438.43%滩涂养殖海水中MS2的回收率实验见下表5表5滩涂养殖海水样本MS2的回收率实验（10个样品）样品名称MS2本底值MS2添加量MS2实测值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相对标准偏差RSD%滩涂养殖海水010μL30.58238.97%30.52%19.13%31.35123.78%31.19726.25%30.8732.39%30.90431.69%30.69136.34%30.61738.11%31.24525.45%31.3523.79%31.07428.41%医疗污水样本中MS2的回收率实验见下表6表6医疗污水样本MS2的回收率实验（10个样品）样品名称MS2本底值MS2添加量MS2实测值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相对标准偏差RSD%医疗污水010μL31.70918.89%22.08%35.62%31.94616.22%31.36223.61%30.97430.29%31.73518.58%31.75418.35%32.49211.42%30.75534.87%31.94316.25%30.87232.35%生产用井水样本MS2的回收率实验见下表7表7生产用井水样本MS2的回收率实验（10个样品）样品名称MS2本底值MS2添加量MS2实测值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相对标准偏差RSD%生产用井水010μL31.30324.52%31.78%21.35%31.14327.18%30.66636.92%31.11827.62%31.45522.24%30.96730.43%30.77234.49%30.90731.63%30.58438.92%30.39943.84%生产灌溉水样本MS2的回收率实验见下表8表8生产灌溉水样本MS2的回收率实验（10个样品）样品名称MS2本底值MS2添加量MS2实测值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相对标准偏差RSD%生产灌溉水010μL30.79134.08%32.53%24.64%31.21226.00%30.68236.55%31.24625.44%31.11827.62%30.56139.50%31.1327.41%30.90731.63%30.17350.69%31.18726.42%现行法律法规、强制性标准和其他有关标准的关系法律法规和强制性标准的关系本标准与相关法律法规、强制性标准保持一致性，不矛盾、不抵触。与其他有关标准的关系推荐性国家标准：推荐性行业标准：SN/T4784-2017推荐性地方标准：DB45/T2138-2020国际标准和国外先进标准：ISO15216-1:2019SN/T4784-2017和ISO15216-1:2019这两个标准只适用于瓶装水中杯状病毒检测。该方法使用膜吸附-洗脱-浓缩阳离子膜-TGBE-超滤管过滤，对污水、生活用水、生产用水、地下水、集中式供水、娱乐用水、医疗机构污水等中杯状病毒进行检测。DB45/T2138-2020《水体中诺如病毒的核酸检测方法实时荧光RT-PCR法》，适应于广西区域内地表水、地下水、集中式供水、娱乐用水、污水等水体基质中诺如病毒的核酸检测。重大分歧意见的处理经过和依据无贯彻该标准的要求和措施建议本方法利用实时荧光RT-PCR法实现水体中杯状病毒的快速定性检测。本方法适用于污水、生活用水、生产用水、地下水、集中式供水、娱乐用水、医疗机构污水等中杯状病毒进行检测。由于现行行标SN/T4784-2017（出口食品中杯状病毒和杯状病