基于双树枝状放大效应的免疫传感器对苯并芘的快速检测

图15(A)聚三联噻吩修饰电极，采用单标记二抗构建的体系；(B)聚三联噻吩-PAMAM修饰电极，使用单标记二抗构建的体系；(C)聚三联噻吩-PAMAM修饰电极，使用多酶-二氧化硅-二抗构建的体系；(D)聚三联噻吩-PAMAM修饰电极，使用多酶-亚甲基蓝/二氧化硅-二抗构建的体系使用带氨基的聚三联噻吩薄膜作为电极表面的第一层修饰物提供起始的氨基，再通过戊二醛偶联PAMAM对氨基进行化学放大，同时PAMAM的空间结构也有利于增大表面积，减少了固定化抗原之间的位阻，PAMAM修饰后的电极表面提供了更多的抗原结合位点，有效地增加了抗原的固定量。在其它条件一致的情况下，图15(A)是没有用PAMAM构建的体系，而图15(B)是使用PAMAM构建的体系，加入30L0.48MH2O2引起的信号变化，这说明PAMAM确实有利于提高传感器的灵敏度。通过二抗把免疫信号转换为电化学信号是电化学免疫传感器的常用方法。然而，传统的单标记方法得到的检测信号小，这将不利于提高传感器的灵敏度。用纳米二氧化硅制备多标记二抗主要是由于二氧化硅良好的生物相容性和表面易改性。然而二氧化硅导电性很差，不利于电子在酶和电极之间的传递。本论文中使用的核壳纳米粒子以亚甲基蓝为内核，亚甲基蓝是良好的电子中介体，可以有效地提高二氧化硅的电子传递能力。不仅如此，纳米材料的应用使得一个二抗分子可以同时连接多个酶分子，当待测物浓度相同时，多标记二抗构建的系统得到的信号比单标记的系统要大许多，这就实现了有效信号的放大，极大地提高了传感器的灵敏度。核壳纳米二氧化硅，核壳粒子的作用不仅仅是偶联二抗与多个酶分子，其内核材料亚甲基蓝是良好的电子中介体，它能够加速电子传递过程，这将有利于电子在电极表面的传递，而电子的传递是酶信号转变为电信号。为了说明多标记方法的优越性，本论文进行了一组对照实验，控制其他条件相同，对照实验C使用多酶-二氧化硅-二抗，对照实验D使用多酶-亚甲基蓝/二氧化硅-二抗。从循环伏安图上可以看出，使用多标记二抗构建的体系在加入30L0.48MH2O2后，电位-0.4V处的还原峰，电流值的变化为相同条件下单标记二抗的两倍，这说明多标记二抗3.9对苯并芘的竞争检测对待测物进行分析检测是免疫传感器的最终目的，无论是传感器构建的设计过程还是对检测条件的优化都是为了得到更稳定、灵敏度更高的分析方法。本论文构建的电化学免疫传感器属于酶标免疫传感器，传感器通过酶分子将免疫反应的生物信号转换为电信号。供氢体HQ在电极表面的氧化还原反应中，HQ为还原态，生成的自由基为氧化态，反应方程如下所示：当H2O2从溶液中扩散到电极表面，被固定在电极表面上的辣根过氧化物酶(HRP)被还原，辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质，HRP(Fe3+)催化还原H2O2，本身生成不稳定的还原态HRP-I，这是一个两电子反应，反应如下式所示[17]：HRP(Fe3+)+H2O2HRP-I+H2OHRP-I在电子传递介体作用下从电极得到电子，进行两步单电子还原反应，最终再被还原回HRP(Fe3+)，反应方程表示如下[18]：HRP-I+HQ(Red)HRP-II+Q(Ox)HRP-II+HQ(Red)HRP+Q(Ox)在整个反应中，HRP酶并没有被消耗掉，而是起催化的作用。在HRP酶和反应底物H2O2的存在下，电极表面还原态的对苯二酚被氧化，氧化态的自由基大幅增加。由于电极处于对苯二酚的溶液中，被消耗的对苯二酚对溶液的浓度改变不大。因此，电化学中氧化峰的电流强度变化不大，而还原峰的电流强度随着H2O2浓度增大发生显著变化。酶促反应速度与酶分子的浓度成正比。当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。因此，电流信号的变化大小与电极表面HRP酶的数量成正比。而酶分子的数量与标记二抗、固定化抗体的数量成正比[19-20]。在优化的条件下，以上述制备的Antigen/PAMAM/NH2-3T/Au传感器探针对苯并芘进行检测，在pH7.4，含有1mM对苯二酚，3.6mMH2O2的溶液中，以100mV/s的速率，从-0.6V到0.8V对其进行CV扫描，以此来观察阴极电流与苯并芘含量的关系，如图16lg(I)=(0.542±0.010)+(−0.141±0.008)lgCBaP其中I为免疫传感器的阴极电流，CBaP为溶液中苯并芘的含量，相关系数r=99.02%，该免疫传感器对苯并芘在0.01-2ng/mL有线性响应，检测限为6pg/mL，该免疫传感器具有较低的检测限，这便说明以导电聚合物-PAMAM和复合纳米多标记二抗为基础的双重放大策略在电化学免疫传感器的构建中具有很大的价值。图16浓度的苯并芘下阴极电流变化图3.10性能表征此外，通过进行三次平行实验以检测实验的重现性，三次平行实验后，得出电流的相对标准偏差为1.85%。将所制得的Antigen/PAMAM/NH2-3T/Au传感器探针浸泡在PH7.4的PBS中，4°C保存三十天后，再次使用时电流强度为刚制备时的92%，这表明该免疫探针具有较好的稳定性，可能与带负电的二氧化硅中包埋了带正电的亚甲基蓝有关。本论文还通过将不同量的苯并芘加入到PBS中作为样本进行测定，然后将实验结果与其真实含量进行对比。分别在含有0.05,0.1,0.3,0.5和1.0ng/mL苯并芘的五个样本中进行检测与对照，最终得到它们的回收率分别为97.1,99.5,98.4,100.9和14结论本文通过制备了PAMAM，用其固定抗原，利用了其树枝状的空间结构优势，有效地提高了电极表面的抗原结合位点，从而提高电极表面抗原的固定量。同时用制备的亚甲基蓝/二氧化硅核壳纳米粒子制备二抗复合物，放大检测信号。通过免疫竞争反应，酶促反应实现对低含量污染物苯并芘的快速检测。5致谢感谢国家重点基础研究发展规划973计划

(2009CB421601)、国家自然科学基金(20827006)、广东省大学生创新实验项目(1056410003)和华南农业大学211项目(2009B010100001)的资助。参考文献：[1]丁峰,沈伟,顾金利等.POPs污染及其治理方法[J].科技情报开发与经济,2009,19(8):151-153.[2]王文兴,童莉,海热提.土壤污染物来源及前沿问题[J],生态环境,2005,14(1):1-5.[3]高翔云,汤志云,李建和等.国内土壤环境污染现状与防治措施[J].江苏环境科技,2006,19(2):52-55.[4]张燕平,邱树毅.持久性有机污染物(POPs)及其生态毒性[J].广东化工,2009,36(10):119-120.[5]鞠熀先.电分析化学与生物传感技术[M].科学出版社,2006.[6]李妍,张培玉.监测环境污染的生物传感器[J].环境研究与检测,2010,04(23):77.[7]SBoujday,SNasri,MSalmainc,etal.SurfaceIRimmunosensorsforlabel-freedetectionofbenzo[a]pyrene[J].BiosensorsandBioelectronics,2010,26(4):1750-1754.[8]YHWu,XQLiu,LZhang,etal.Anamperometricbiosensorbasedonratcytochromep4501A1forbenzo[a]pyrenedetermination[J].BiosensorsandBioelectronics,2011,26(5):2177-2182.[9]HYao,NLi,SXu,etal.Electrochemicalstudyofanewmethyleneblue/siliconoxidenanocompositionmediatoranditsapplicationforstablebiosensorofhydrogenperoxide[J].BiosensorsandBioelectronics,2005,21(2):372-377[10]SBerchmans,PArunkumar,SLalitha,etal.PreparationofcatalyticfilmsofplatinumonAusubstratesmodifiedbyself-assembledPAMAMdendrimermonolayers[J].AppliedCatalysisB:Environmental,2009,88(3-4):557-563.[11]周卓华.羟基磷灰石/PAMAM纳米复合材料的水热合成及其形貌控制[D].上海师范大学硕士论文,2007.[12]周玉兰,刘永利,杨华等.聚酰胺-胺型树状大分子化合物的合成研究[J].首都医科大学学报,2001,22(04):321-326.[13]司宝财.树枝状大分子复合磁性颗粒的制备与表征[D].哈尔滨工程大学硕士论文,2007.[14]曲祥金,李金焕,艾仕云.树状高分子PAMAM的合成及其性能研究[J].山东农业大学学报(自然科学版),2008,39(3):429-432.[15]TPZhong,PFAi,JZhou.StructuresandpropertiesofPAMAMdendrimer:Amulti-scalesimulationstudy[J].FluidPhaseEquilibria,2011,302(1-2):43-47.[16]刘志广.仪器分析[M].高等教育出版社,2007,7:276-313.[17]王朝瑾,应太林,吴芯芯等.辣根过氧化物酶传感器的研究-对苯二酚为电子传递体[J].食品科学,1998,19(8):49-51.[18]RPLiang,HDQiu,PXCai.Anovelamperometricimmunosensorbasedonthree-dimensionalsol-gelnetworkandnanoparticleself-assembletechnique[J].AnalyticaChimicaActa,2005,534(2):223-229.[19]JZXu,JJZhu,QWu,etal.Anamperometricbiosensorbasedonthecoimmobilizationofhorseradishperoxidaseandmethyleneblueonacarbonnanotubesmodifiedelectrode[J].Electroanalysis,2003,15(3)