南海红树林底泥来源放线菌no

南海红树林底泥来源放线菌no

真菌病是一种多发性疾病，很难治愈。近年来,随着全球气候变化,温室效应的加剧,由真菌引起的疾病,特别是诸如手足甲癣及深部真菌病等日趋严重。同时,随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的应用、肿瘤化疗和器官移植手段、艾滋病的出现,以及导管、插管等在大型手术中的普遍开展,使真菌感染的发病率呈现上升趋势,全身用抗真菌药物成为抗微生物药的研究热点之一。海洋微生物次生代谢产物是新颖结构和活性天然产物的重要来源,也是具有新颖结构和新作用机理的抗真菌药物发现的重要源泉。在海洋微生物中,放线菌是迄今最重要和最大的药用微生物种群。据不完全统计,近年来50%以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群产生的。因此,开发海洋放线菌具有巨大的潜力。本研究团队以深部真菌感染的主要致病菌白色念珠菌(Candidaalbicans)为指示菌,采用纸片扩散法(KirbyBauer,KB法)测定样品的抑菌活性,从两千余株采自世界各地的放线菌中筛选得到一些具有较好的抗真菌活性菌株。选取其中一株海洋放线菌H75-11进行活性追踪,并最终追踪和分离得到天然抗真菌活性抗生素抗霉素(antimycin),本研究主要报道该株放线菌的发酵、活性成分的提取分离和结构鉴定。1实验材料1.1放线菌菌放线菌No.H75-11由广东省农业科学院植物研究保护所保存和提供,菌株从广东湛江近海红树林的底泥中分离得到。1.2水ms47h2o高氏一号培养基:可溶性淀粉20g,KNO31g,K2HPO40.5g,NaCl0.5g,FeSO40.01g,MgSO4·7H2O0.05g,琼脂15g,水1000mL,pH7.2～7.4。摇瓶培养基:KNO31g,K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO40.01g,海水晶0.5g,可溶性淀粉20g,酵母膏20g,水1000mL,pH7.2～7.4。1.3高分辨质谱、ndmo紫外光谱(UV)用JASCOV-550紫外/可见光谱仪测定;ESI-MS采用FinniganLCQAdvantageMAX质谱仪;高分辨质谱采用Agilent6210LC/MSDTOF质谱仪测定;核磁数据采用BrukerAV-400型核磁共振仪测定;硅胶(200-300目)(青岛海洋化工厂);SephadexLH-20(Pharmacia公司);核磁用氘代试剂(Merck公司);色谱级甲醇(山东禹王公司);液相用水(广东怡宝公司生产的纯净水);其它试剂均为分析纯。2发酵罐、放大培养菌种活化:将保存的菌种转接到高氏一号培养基中,30℃培养7d。摇瓶培养:挑取活化的菌种转接到装有100mL摇瓶培养基的500mL三角瓶中,30℃、200r·min-1条件下培养5d。发酵罐放大培养:采用Biostatc30L生物发酵罐进行放大培养,所用培养基为高氏一号液体培养基,30L罐装液量20L,初始pH值7.0～7.2,种龄48h,接种量10%,发酵温度:28℃,搅拌速度300r·min-1,通气量15L·min-1,培养3d。整个发酵过程中pH值先降低后缓慢增高。3醇中脂肪酸的萃取通过预试验的活性追踪可知,发酵液无明显抑菌活性,活性成分主要集中在菌丝体的乙酸乙酯萃取部位。因此活性成分提取工艺如下:收集发酵第3天的产物,8000r·min-1离心30min,收集菌体,将菌丝体置于pH3.0、70%乙醇中振荡24h,浓缩醇提液,样品用一定量的90%甲醇水溶解,然后用等倍量的石油醚萃取4次,除去里面大量的脂肪油成分,甲醇部位浓缩,加一定量水混悬,乙酸乙酯萃取4次,萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物6.1g。乙酸乙酯萃取物6.1g经硅胶柱色谱,石油醚/丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脱,最后再用甲醇冲柱,获得B1～B13共13个馏分,采用上述纸片扩散法,以白色念株菌为指示真菌,测试这13个馏分的抑菌圈大小,结果显示馏分B4与B5具有明显的抑菌效果,将B4与B5合并成B4-1(1.17g),将活性馏分B4-1经反复的硅胶柱色谱和SephadexLH-20凝胶纯化,获得6个化合物1(9mg),2(20mg),3(9mg),4和5(共13mg)及6(5mg)。4化合物结构鉴定化合物1:白色针晶,分子式C28H44O3。ESI-MSm/z:429[M+1]+,879[2M+Na]+.1HNMR(400MHz,CDCl3,TMS内标):δ6.49(1H,d,J=8.4Hz,H-7),6.23(1H,d,J=8.4Hz,H-6),5.20(1H,dd,J=15.3,7.8Hz,H-23),5.17(1H,dd,J=15.3,7.8Hz,H-22),3.96(1H,m,H-3),0.99(3H,d,J=6.6Hz,H-21),0.90(3H,d,J=7.0Hz,H-28),0.87(3H,s,H-19),0.82(3H,d,J=6.8Hz,H-27),0.82(3H,s,H-18),0.80(3H,d,J=6.8Hz,H-26).13CNMR(100MHz,CDCl3,TMS):δ135.4(C-22),135.2(C-6),132.3(C-23),130.7(C-7),82.1(C-5),79.4(C-8),66.4(C-3),56.2(C-17),51.7(C-14),51.1(C-9),44.5(C-13),42.7(C-24),39.7(C-20),39.3(C-12),36.9(C-4,10),34.7(C-1),33.0(C-25),30.0(C-2),28.6(C-16),23.4(C-11),20.8(C-21),20.6(C-15),19.9(C-27),19.6(C-26),18.1(C-19),17.5(C-28),12.8(C-18)。以上数据与文献数据基本吻合,确定化合物1为过氧化麦角甾醇。化合物2:白色粉末,分子式C4H4N4O2,ESI-MSm/z:247[2M+Na]+,147[M+Cl]-.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ5.45(1H,dd,J=7.6,1.1Hz),7.38(1H,dd,J=7.6,5.7Hz),10.81(1H,s),11.01(1H,s).13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ100.2(CH),142.2(CH),151.5(C),164.3(C).以上数据与文献数据基本吻合,确定化合物2为尿嘧啶。化合物3:淡黄色针晶,ESI-MS实验给出m/z:437[M+Na]+和851[2M+Na]+,ESI-HR-MS给出m/z:437.18030(理论计算值:437.17954),表明分子式C21H26O5N4。化合物的1HNMR(400MHz,吡啶-d6)在高场区出现三组信号δ1.15(3H,t,J=7.0Hz),2.36(3H,s),4.22(2H,q,J=7.0Hz),推测存在CH3CH2O-和CH3-片断,在芳香氢区出现一组1,2,4-三取代苯环信号:δ:7.17(1H,d,J=8.2Hz),7.67(1H,dd,J=8.2,2.2Hz)和8.4(1H,d,J=2.2Hz),另在δ9～10之间出现两个单峰Ha[δ:9.26(1H,s]和Hb[δ:9.57(1H,s)],经HSQC谱证实为连在氮上的氢。13CNMR(100MHz,DMSO-d6)谱只出现11根碳信号,表明化合物3为一对称性化合物,其在sp2杂化区出现6个苯环的碳信号[δ115.1(CH),115.8(CH),124.7(C),131.1(CH),137.9(C)和139.3(C)],而在δ153.9和155.2的两个信号为羰基碳。结合HSQC、DEPT、HMBC、1H-1H-COSY谱可得到如fig.2所示的片断1:δH为2.36(3H,s)的甲基连在苯环的4位上,CH3CH2O-片断则与氨基甲酸(carbamicacid)成酯并通过N端连于苯环的3位上,而苯环的1位连有亚氨基团(如Fig.2所示),且Hb与另一酰基(δC153.9)相关。至此,化合物所有的1H、13CNMR信息都得到归属,但所得到的片段1的分子组成仅为C10H13O2N2,与相对分子质量C21H26O5N4相比少了C11H13O3N2的分子组成,可认为化合物是以δC153.9的酰基为对称中心的对称结构,即为[N,N′-(3,3′-二乙基二氨基甲酸酯)-(4,4′-二甲基)]-二苯基脲([N,N′-(3,3′-diethyldicarbamate)-(4,4′-dimethyl)]-diphenylurea),通过与SciFinder数据库提供的该化合物1H、13CNMR预测数据(ACD/Labs)SoftwareV9.07比较,进一步确定为该化合物。化合物4与化合物5:白色粉末,ESI-MSm/z571.2[M+Na]+,547.9[M-H]-,HR-ESI-MSm/z548.27484。化合物4的核磁数据如下:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ12.63(1H,s,2′-OH),8.55(1H,d,J=8.1Hz,H-4′),8.52(1H,d,J=1.7Hz,H-8′),8.08(1H,br,3′-NH),7.26(1H,d,J=8.3Hz,H-6′),7.12(1H,d,J=7.7Hz,H-7′),6.92(1H,t,J=8.1Hz,H-5′),5.76(1H,p,J=7.0Hz,H-4),5.33(1H,t,J=7.7Hz,H-3),5.12(1H,t,J=9.9Hz,H-8),4.99(1H,m,H-9),2.52(1H,m,H-7),2.42(1H,m,H-2ue087),1.75(1H,m,Ha-3ue087),1.52(1H,m,Hb-3ue087),1.32(3H,d,J=6.7Hz,4-CH3),1.29(3H,d,J=6.4Hz,9-CH3),1.25(10H,m,H-1″,2″,3″,4″and5″),1.19(3H,d,J=7.0Hz,H-5ue087),0.95(3H,t,J=7.4Hz,H-4ue087),0.86(3H,t,J=7.1Hz,H-6″).13CNMR(100MHz,CDCl3):δ175.2(C-1″),172.9(C-6),170.1(C-2),169.3(C-7′),159.2(C-8′),150.6(C-2′),127.5(C-3′),124.8(C-4′),120.1(C-6′),118.9(C-5′),112.6(C-1′),75.4(C-8),74.9(C-9),70.9(C-4),53.6(C-3),50.1(C-7),41.2(C-2″),31.4(C-4ue087),28.9(C-5ue087),28.5(C-1ue087),27.0(C-3ue087),26.4(C-3″),22.4(C-2ue087),17.8(9-CH3),16.7(C-5″),15.0(4-CH3),14.0(C-6ue087),11.7(C-4″)。化合物5的核磁数据如下:1HNMR(400MHz,CDCl3):δ12.63(1H,s,2′-OH),8.55(1H,d,J=8.1Hz,H-4′),8.52(1H,d,J=1.7Hz,H-8′),8.08(1H,br,3′-NH),7.26(1H,d,J=8.3Hz,H-6′),7.12(1H,d,J=7.7Hz,H-7′),6.92(1H,t,J=8.1Hz,H-5′),5.76(1H,p,J=7.0Hz,H-4),5.33(1H,t,J=7.7Hz,H-3),5.12(1H,t,J=9.9Hz,H-8),4.99(1H,m,H-9),2.52(1H,m,H-7),2.26(2H,d,J=6.8Hz,H-2ue087),2.15(1H,m,H-3ue087),1.32(3H,d,J=6.7Hz,4-CH3),1.29(3H,d,J=6.4Hz,9-CH3),1.25(10H,m,H-1″,2″,3″,4″and5″),0.99(3H,d,J=6.6Hz,H-4ue087),0.99(3H,d,J=6.6Hz,H-5ue087),0.86(3H,t,J=7.1Hz,H-6″).13CNMR(100MHz,CDCl3):δ172.9(C-6),171.6(C-1″),170.1(C-2),169.3(C-7′),159.2(C-8′),150.6(C-2′),127.5(C-3′),124.8(C-4′),120.1(C-6′),118.9(C-5′),112.6(C-1′),75.4(C-8),74.9(C-9),70.9(C-4),53.6(C-3),50.1(C-7),43.2(C-2″),31.4(C-4ue087),28.9(C-5ue087),28.5(C-1ue087),27.0(C-3ue087),25.5(C-3″),22.4(C-4″),22.4(C-2ue087),22.4(C-5″),17.8(9-CH3),15.0(4-CH3),14.0(C-6ue087)。通过以上数据与文献比较,结合DEPT、HSQC和HMQC图谱数据分析,鉴定化合物4和5分别为抗霉素A1a(antimycinA1a)和抗霉素A1b(antimycinA1b),且存在于同一样品中,但HPLC已无法分离。化合物6:白色粉末,ESI-MS实验给出m/z:213[M+Na]+和167[M-H-44(CO2)]-,结合1H、13CNMR谱推测化合物的分子式为C11H12O5。化合物的1HNMR(400MHz,acetone-d6)信号如下:δ7.59(1H,dd,J=8.0,1.6Hz),7.57(1H,d,J=1.6Hz),6.91(1H,d,J=8.0Hz),