近海海泥链霉菌分离条件的研究

近海海泥链霉菌分离条件的研究

海洋微生物的栖息地与地球追踪微生物非常不同，因此与地球突变微生物产生的一些特定的生物活性物质不同。其生物活性物质种类包括新型抗生素、抗癌药物、不饱和脂肪酸、酶、酶抑制剂、维生素等,这些活性物质的化学结构丰富多样、分子结构独特新颖、具有极大的药用潜力。放线菌是产生抗生素等活性物质种类最多的一类微生物,其中又以链霉菌(Streptomyces)为主。目前在农业和医药领域,有2/3的抗生素来源于链霉菌,因此,从海洋链霉菌中寻找生物活性物质并开发研究特效药物是前途广阔、易获得重大科研成果的新领域。海洋链霉菌资源的开发,关键的一步是将海洋中的资源菌株分离出来。调查表明:在近海区,海洋放线菌与陆栖放线菌相似,也是以链霉菌占优势,但因其生长环境不同,其分离技术也有所不同。因此,我们对近海海泥中链霉菌的分离技术作如下研究。1材料和方法1.1海洋污泥的收集经初步试验,选择含链霉菌丰富的海洋泥样No20(采自广东电白博贺近海)、No41(采自广东阳江闸坡近海)供试。1.2培养基的制备培养基:高氏1号琼脂培养基、精氨酸甘油琼脂培养基、察氏琼脂培养基、燕麦粉琼脂培养基、黄豆粉琼脂培养基,以及改良HV琼脂培养基(g/L):新鲜海泥浸提液200ml、Na2HPO40.5g、KCl1.7g、琼脂15g。以上培养基以采自广东电白博贺近海陈海水配制好后灭菌备用。1.3平板的制备称取海泥样品1g,加入含玻璃珠的10ml无菌海水,激烈振荡制成均匀的混悬液,静置20min,取上清液逐级稀释为10-2、10-3、10-4和10-5,各取0.2ml,分别涂平板,每处理4个重复。28℃培养7～10d,观察分离结果,并记录。2结果与分析2.1高氏代酸盐管将采集的新鲜海泥取样两份,一份密闭置于4℃冰箱内保存,另一份在28℃条件下自然风干,用高氏一号琼脂培养基分离链霉菌。海泥经风干后,链霉菌的数量下降较少,而细菌的数量急剧下降(表1)。2.2种方法所需时间分离前,对土样进行热处理可活化链霉菌孢子,提高链霉菌分离数量。其方法一般是直接处理土样,这种方法所需时间较长。我们设计在泥样剧烈振荡混匀后,于不同温度水浴里静置处理土壤悬液20min,再用同温度的无菌海水进行稀释。分离结果见表2:40℃处理土壤悬浮液20min可显著提高链霉菌的分离数量;50℃时,链霉菌的出菌率下降,当处理温度升到60℃时,分离到的链霉菌数量极少。2.3培养基上链霉菌种类及数量将风干的土样制成土壤悬浮液,于40℃水浴中热处理20min,稀释后接于不同培养基中分离链霉菌,并根据链霉菌基丝、气丝和可溶性色素等特征初步确定链霉菌的种类数。由表3可见:高氏一号琼脂培养基上分离的链霉菌种类和数量最多,改良HV琼脂次之,且两种培养基分离的链霉菌种类包括了其他4种培养基上的全部类型。改良HV琼脂培养基上链霉菌种类多于高氏一号琼脂培养基。另外改良HV琼脂培养基上的细菌数量最少,高氏一号琼脂次之,这两种培养基上的细菌数量对链霉菌挑取干扰不大。而黄豆粉琼脂培养基上链霉菌的出菌率最低,且细菌数量最多。说明利用高氏一号琼脂培养基和改良HV琼脂培养基,可以从泥样中分离出大部分链霉菌,且细菌干扰小,一般不影响链霉菌的挑取。2.4不同海水浓度的土壤污染物分离结果以高氏一号琼脂作为分离培养基,陈海水浓度分别为0、20%、40%、60%、80%和100%,泥样经风干处理,土壤悬浮液经40℃水浴20min,分离结果见表4。海水浓度在60%～80%时,出菌率高于100%海水。尤其是土样No41海水浓度60%时分离的链霉菌数量比100%海水增加近20%。当海水浓度下降到40%以下时,链霉菌的分离数量明显下降。近海海水经常被流入的江水和雨水稀释,盐度降低,因此近海泥样中的链霉菌适应相对低盐度环境。2.5nacl浓度对链霉菌的出菌率用海水配制的培养基对链霉菌的分离效果较好,但有时海水的采集有一定的难度。本试验用一定浓度的NaCl溶液取代海水做了初步研究。以高氏一号琼脂作为分离培养基,NaCl浓度分别设为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,3.5%和4.0%,以纯海水作对照,泥样经风干处理,土壤悬浮液经40℃水浴20min,分离结果见表5。NaCl浓度在2%～3%范围内链霉菌的出菌率较高。当NaCl浓度增加到3.5%时,链霉菌数量明显下降。另外,研究结果显示用海水配制培养基的分离效果明显高于NaCl配制的培养基。3不同培养基对链霉菌的分离效果将海泥泥样进行风干处理,用高氏1号琼脂培养基及改良HV琼脂培养基分离链霉菌时,极少有真菌污染,对链霉菌的出菌率的影响不大,但细菌的数量显著减少,大大有利于链霉菌的挑取,可以不使用抑制剂就达到很好的分离效果。其原因是细菌对干燥比较敏感,而链霉菌的孢子比较耐干燥,因此风干处理后,土样中水分丢失,使大量细菌失去活力。用40℃水浴处理土壤悬浮液20min,可促进链霉菌孢子的萌发,增加链霉菌的出菌率。可见,用水浴处理可达到司美茹等报道的对土样进行热处理促进孢子萌发的相同效果,又减少了处理时间,提高了效率。高氏1号琼脂培养基和改良HV琼脂培养基对链霉菌的分离效果较好,且培养基上的细菌量少。我们在分离链霉菌的过程中发现,同样重量的近海海泥中的链霉菌和细菌数量要比土壤中的少很多,这与林丽玉等报道的一致。配制分离培养基时,海水的含量在60%～80%范围内,链