锁阳多糖的提取工艺优化及其抗氧化性研究

锁阳多糖的提取工艺优化及其抗氧化性研究

cyboroncordicpainter被记录为对草本后裔的补充遗迹。又名不老药、锈铁棒、不拉羊，是锁阳科的一种植物。锁阳的干燥肉茎是中国沙漠地区宝贵的传统医疗材料。它生长在干燥的多沙地区，主要分布在甘肃、宁夏、新疆等西北部。锁阳多寄生在蒺藜科植物白刺根之上,也有寄生在该科的骆驼蓬根上的,茎肉质、圆柱形、直立,基部略增粗或膨大,埋于沙中。花期5~6月,果期8~9月。春秋季采挖,以春季产者为佳。在中医上,把锁阳植物的去花序干燥茎用做传统的中药锁阳,锁阳性甘温,入肝、肾经,补肾助阳、益精血,润燥养精治痿弱,延缓衰老等。现代药理学研究证明,它还有防癌、抗癌、耐缺氧、抗应激、抗疲劳作用;清除体内自由基、抗氧化、抗衰老,抑制血小板聚集,调节免疫系统,抑制艾滋病病毒增殖及对防治心血管疾病等有明显的效果。由于沙漠植物的特殊性及种子萌发的特点。目前,人工栽培技术尚未成熟,使这种宝贵的药物资源未得到充分的保护和利用。希望其本身得到合理开发与应用。目前多糖提取方法很多,如热水浸提法、碱提法、微波法、超声波辅助法等。而其中的热水浸提法工艺流程易操作且简单是多糖提取常用的方法之一,本实验首次对宁夏产区锁阳进行相关化学成分的研究。通过对多糖提取工艺的研究并且在单因素基础之上采用三因素三水平响应曲面法对热水浸提锁阳多糖工艺进行优化。从而确定出了最佳提取工艺参数,为提高该产区锁阳综合利用提供基础数据。此外,通过对锁阳粗多糖的体外抗氧化性的研究验证了其具有一定的总还原能力及清除自由基作用。这些都有助于对这种珍贵药用资源的进一步研究提供了一定依据。1材料和方法1.1光度计和设备锁阳采自宁夏回族自治区平罗县陶乐镇,由段玉峰教授鉴定为锁阳;95%乙醇、75%乙醇等均为国产分析纯。TU-1810型紫外-可见光分光光度计北京普析通用有限责任公司;CS101-2AB型电热干燥箱上海福玛实验设备有限公司;FW-80型高速粉碎机河北省黄骅市新兴电器厂。1.2锁阳粉末的制备首先,将锁阳置于烘箱内设置温度于60℃直至烘干为止,将烘干后的锁阳高速万能粉碎机粉碎,过60目筛,从而得锁阳粉末以备用。而后用75%乙醇80℃脱脂2h。1.3多酚测定1.3.1苯酚吸收度测定精确称取干燥恒重的D(+)葡萄糖0.05g,置于100mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,精确量取该溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL分别置50mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,再精确量取上述溶液2mL于试管中,分别加入5%苯酚0.4mL,迅速加入浓硫酸以2.0mL以蒸馏水作为空白对照,摇匀,于25~30℃水浴保温10~20min,于490nm波长处测其吸收度。以吸光度值作为纵坐标,以葡萄糖的质量浓度为横坐标绘制标准曲线,从而得到葡萄糖标准线性回归方程。1.3.2提取率和多糖含量取一定浓度的锁阳样品溶液1.0mL,加蒸馏水至2.0mL,测定吸光度值,依据线性回归方程计算出多糖含量(图1)。多糖含量计算公式:C=(A-0.0294)/0.0986×n式中,A:样品的吸光度;C:样品浓度(mg/mL);n:稀释倍数。多糖提取率计算公式:多糖提取率(%)=(C×V/样品质量)×100式中,C:样品浓度(mg/mL);V:浸提液体积(mL)。1.3.3粗多糖的制备锁阳干粉末→脱脂(75%乙醇80℃脱脂2h)→热水浸提→抽滤取上清液→减压浓缩→醇沉(3倍体积的95%乙醇置于4℃冰箱静置12h)→沉淀→除蛋白→离心取上清液→溶解、透析48h→冷冻干燥→得锁阳粗多糖。1.4实验设计1.4.1单因素实验1.4.1.料液比对各提取多糖效果的影响准确称10g锁阳粉末6份,分别置于500mL圆底瓶中,在提取温度为90℃,提取时间为2.5h,料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL的条件下各提取多糖,测定其多糖的提取率。1.4.1.提取时间对多糖提取率的影响准确称10g锁阳粉末6份,分别置于500mL的圆底瓶中,料液比1∶15,浸取温度90℃,在浸提取时间分别为1、1.5、2、2.5、3、3.5h的条件下各提取一次,采用苯酚-硫酸法测定其多糖的提取率。1.4.1.提取率的测定准确称10g锁阳粉末6份,分别置于500mL的圆底瓶中,料液比1∶15,提取时间2.5h,在提取温度分别为75、80、85、90、95、100℃的条件下各提取多糖,采用苯酚-硫酸法测定其多糖的提取率。1.4.2实验模型以单因素实验为基础,采用Box-Behnkex实验设计,选取三因素三水平的响应曲面分析法,以料液比、浸提时间(h)、浸提温度(℃)、为实验因子,多糖提取率为实验指标,确定最佳实验组合。因素水平表见表1。1.5粗多糖的提取最佳的工艺条件下,按1.3.3方法进行锁阳粗多糖的提取。锁阳粗多糖待测液的配制:准确地将锁阳粗多糖配成1.0mg/mL,再根据每组实验用去离子水将该溶液稀释成5种不同浓度。1.5.1铁氰化钾/h总还原力的测定是用来评价抗氧化活性的常用方法。具体方法是于2.5mL不同浓度的锁阳多糖溶液中加入2.5mL、0.2mol/L、pH=6.6的磷酸盐缓冲液和2.5mL、1%的铁氰化钾溶液,50℃水浴30min,快速冷却至室温。加入2.5mL、10%的三氯乙酸(TCA)溶液,3000r/min离心10min左右,取上清液5mL,加入4mL去离子水,再加入1mLFeCl3(0.1%),混匀,静置10min,于700nm处测其吸光度值。以VC作为对照,每组做3次重复实验,求其平均值。1.5.2清除苯三酚自氧化速率测定采用邻苯三酚自氧化法。取Tris-HCl缓冲溶液4.5mL,在25℃下水浴中保温20min,加入邻苯三酚(25℃预热),快速振荡摇匀,再在325nm波长下,每隔30s记录一次值,连续记录6次。试样在相同条件下测定吸光度值。以VC为对照,每组实验做3次重复,求其平均值。计算公式如下:清除率(%)=(A0-A)/A0×100式中:A0—邻苯三酚的自氧化速率;A—加入样品后邻苯三酚的自氧化速率。1.5.3dpph清除实验(DPPH·)自由基常用来评估抗氧化物的供氢能力。于1mL不同浓度的锁阳多糖溶液加入3mL、2×10-4mol/LDPPH·溶液(用95%乙醇配制),充分混匀,室温静置35min。然后在517nm波长处测定其吸光度值,VC作阳性对照,以95%乙醇调零,每个处理试样均做三次重复实验,计算各试样对DPPH·的清除率公式为:清除率(%)=[A0-(A1-A2)/A0]×100式中,A1—加入样品后的吸光度值;A2—样品吸光度值;A0—空白吸光度值。1.5.4清除vc的测定利用Smironff法反应产生的羟基自由基可氧化水杨酸,使水杨酸产生有色物质,在510nm波长处有强吸收峰。于2mL不同浓度的锁阳多糖溶液中加入2mLFeSO4溶液(6mmol/L)、2mLH2O2(6mmol/L)溶液,充分摇匀,静置10min。加入6mmol/L的水杨酸溶液2mL,充分摇匀,静置30min,在510nm处测定其吸光度值。以VC作阳性对照,每组试样均做三次重复实验。计算公式为:清除率(%)=[A0-(A1-A2)/A0]×100式中,A1—加入试样后的吸光度值;A2—样品吸光度值;A0—空白吸光度值。1.6处理数据各组实验都进行三次重复,实验数据均以平均值±标准差表示。采用Design-Expert7.1.3软件进行数据分析、统计并作图。2结果与分析2.1葡萄糖质量浓度计算葡萄糖标准曲线如图1所示,线性回归方程为Y=0.0993x-0.0284,相关系数为R2=0.9990,式中,y为吸光度值,x为葡萄糖质量浓度。在葡萄糖的质量浓度范围1~7mg/mL时,葡萄糖浓度和吸光度之间呈现出较好的线性关系。2.2单因素实验2.2.1浸提液用量对多糖提取率的影响如图2可以所示,在温度为90℃,提取时间2.5h,随着料液比例的增大,多糖的提取率逐渐呈增高,但当料液比达到1∶25以后,继续增加料液比例,多糖的提取率反而减小。可能原因有起初浸提液含量较小,体系的黏稠度较大,浸提后体系内存在着一定乳化现象,酶与底物接触并不充分,从而导致酶解效果较差;随着料液比的增大,乳化现象减弱,酶解效果增强,当料液比达到一定比例时,底物浓度较低,从而影响了酶解效果,导致锁阳多糖提取率下降,故从单因素实验结果选择料液比为1∶25。2.2.2提取温度对多糖提取率的影响图3所示,在料液比为1∶25,提取时间为2.5h,起初多糖提取率较低,但随着温度的升高多糖提取率逐渐升高,但当提取温度高于90℃时,多糖的提取率呈现下降趋势,原因可能是温度较低时,分子扩散运动能力较弱,物料的空化作用不够完全。而当温度达到一定程度会破坏多糖的分子结构,影响多糖提取率,使得其提取率降低,由实验结果故选择提取温度90℃为最佳。2.2.3不同浸提时间对多糖提取率的影响由图4所示,在料液比为1∶25,提取温度为90℃情况下,在多糖的提取过程中,随着浸提时间的延长,多糖的提取率在升高,但当浸提时间达到2.5h后,提取率有所下降,原因可能是由于多糖分子在长时间高温提取过程中受到破坏所致。结合实验结果故选择最佳的浸提取时间应为2.5h。2.2.4热水浸提取率的预测及分析利用SAS9.0分析软件对表2实验数据进行二次多项拟合,得热水浸提法对锁阳多糖提取率与料液比、提取温度、提取时间之间的多元回归方程如下所示。Y=21.81+0.36X1+0.41X2-0.30X3+0.31X1X2-0.26X1X3+0.44X2X3-0.82X12-0.35X22-0.84X32由表3知,失拟项不显著(p=0.2774>0.05),模型极显著(p<0.01),模型的校正系数R2adj=99.62%,表明此模型能解释99.74%响应值的变化,相关系数R=0.9987,表明此模型拟合度较好,实验误差较小。综上表明模型合适可以分析及预测热水浸提法提取锁阳多糖的提取率。由表4回归方程系数显著性检验可知,实验设计中,一次项X1、X2、X3显著(p<0.05),二次项X12、X32显著,X22、X1X2、X2X3不显著,其余项均显著。此外,还可以看出各因素对多糖提取率影响大小顺序为:浸提时间(X3)>料液比(X1)>浸提温度(X2)。2.2.5不同浸提温度和料液比对锁阳多糖得率的影响热水浸提法提取锁阳多糖响应曲面见图5~图7,由以下3组图可知各因素对响应值的影响。从响应曲面的平面投影形状可以看出交互作用的强弱,椭圆则表示两因素之间交互作用显著,而圆形表示两因素交互作用不显著。由图5可知,提取温度和料液比对提取多糖的交互影响不显著。浸提温度对应的响应曲面坡度较陡,表明其对多糖提取率的影响显著。浸提温度和料液比分别75~90℃和1∶5~1∶25的范围内时,多糖的提取率逐渐增大可达到最大。如图6所示,在浸提温度和提取时间分别90℃,2.5h时,浸提取时间和料液比对锁阳多糖的交互影响效应显著。浸提时间所对应的响应曲面坡度较陡,说明浸提时间对提取率的影响显著。浸取时间和料液比分别在1~2.5h和1∶5~1∶25的范围内时,多糖的得率达到最大。由图7可知,在料液比1∶25时,浸提时间与浸提温度对锁阳多糖的交互效应不显著。在实验范围内,浸提时间和浸提温度对应的响应曲面坡度比较陡,从而说明浸提时间和浸提温度对提取率影响较大,当浸提温度低于90℃时,提取率随着浸提温度的增大而升高,当超过这一温度,提取率反而随温度的增大而降低。浸提时间及浸提温度分别为1~2.5h和75~90℃的范围内,锁阳多糖的得率逐渐增大可达到最大。2.2.6在添加料液比2.5%的条件下提取多糖据响应曲面设计得出的最佳条件分别为浸提取时间2.57h,浸提温度90.4℃,料液比1∶25.7,在此条件下锁阳多糖的得率为22.03%。鉴于实验易操作性将条件优化为料液比1∶25,提取温度90℃,提取时间2.5h。此条件下多糖实际得率为22.32%,与预测值相对误差不到1%。结果表明响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确且较为可靠,所得的多糖提取条件有一定的应用价值。2.2.7综合氧化试验的结果2.2.7.还原力与吸光度的关系化合物的还原能力可以作为潜在的抗氧化活性的一个重要指标。通常情况下,样品的还原能力与抗氧化性呈一定的相关性;样品反应后生成物在700nm处有最大吸收,吸光度值大小反映了抗氧化活性的大小,吸光度值越大,则样品的还原能力越强。由图8可知,锁阳多糖在一定质量浓度范围内有显著的还原能力,并随着浓度增加而增加。且质量浓度在0.2~1.0mg/mL范围内,与还原力呈现明显量效关系。在测定的浓度范围内,锁阳多糖的还原能力明显低于VC。2.2.7.量效关系及浓度由图9可知,不同浓度锁阳多糖对H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH都具有清除作用,且随浓度的增加,清除率上升,呈现出显著的量效关系。在质量浓度为0.4mg/mL时,其VC清除率为70.30%,锁阳多糖清除率为10.30%,表明锁阳多糖具有体外抗氧化活性。2.2.7.锁阳多糖清除率及在不