神经红蛋白的分离纯化及谱学表征

神经红蛋白的分离纯化及谱学表征

神经红蛋白（ngb）是德国科学家burmat发现的一种新的白亚氏。主要用于脑、视网膜和其他神经组织。神经红蛋白显示了珍珠蛋白的三维结构特征（图1），但与动物红蛋白相比，氨基酸序列的同源性较低（20%25%）。序列分析表明，神经红蛋白比肌红蛋白更古老。与以前的珍珠蛋白不同，在低铁和高铁条件下，神经红蛋白有六个附着结构，远端氨基酸（s7）的脱希尔原子（细胞的第六个位置）占据了第六个位置。这是对动物的第一次。目前，它的生理功能是：（1）通过促进氧气和分配氧代谢细胞的颗粒，最高氧化能力为通过糖转化反应提高。（3）作为o2受体，其他蛋白激活，如调节功能。（4）这与no新陈代谢有关。（5）对于以血液为基础的缺氧和缺氧破坏，对ngb的基本性质以及结构性质-功能关系的了解还不够充分。为了进一步研究神经红蛋白的化学生物学基础及其潜在功能，本文报道了神经红蛋白的基因表达、分离和性质组成以及光谱性质的初步表现。1western-pcr检测e.coli蛋白的表达(ⅰ)仪器与材料试剂.AKTApurifier100快速蛋白纯化系统(AmershamBiosciences,Sweden),JascoJ-810圆二色谱仪(Japan),HP8453A型紫外可见阵列二极管分光光度计(USA),LS55型荧光分光光度计(PerkinElmer,USA).带有神经红蛋白基因的pET3a质粒由德国JohannesGutenbergUniversityofMainz大学Burmester教授惠赠.E.ColiBL21(DE3)plys为本实验室保存,酵母提取物和胰蛋白胨(OxoidLtd.,England),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Sigma),二硫苏糖醇(DTT)(Canda分装),其他试剂均为分析纯或生化试剂.(ⅱ)神经红蛋白的基因克隆.质粒的抽提与纯化、感受态细胞的制备、新鲜转化子的制备均按常规分子生物学方法进行.基因测序由华大中生科技发展有限公司完成.(ⅲ)神经红蛋白的表达与纯化.按文献的方法加以改进.将带有人神经红蛋白基因pET3a质粒转化至E.ColiBL21(DE3)plys中,在含100μg/mL氨苄青霉素,20μg/mL氯霉素的TB(含胰化蛋白胨12g/L,酵母提取物24g/L,甘油4mL/L)固体培养基上进行培养,筛选含有该基因的单菌落.挑取单菌落接种于小量TB(含氨苄青霉素100μg/mL,氯霉素20μg/mL)液体培养基,于250r/min,37℃培养3h后,按1%量转入另一大量TB(含氨苄青霉素100μg/mL,氯霉素30μg/mL)液体培养基中,200r/min,25℃培养至A550=0.8,然后加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L,用封口膜封口,诱导表达12h,于4℃,5000r/min离心15min,收集红色菌体,并用pH8.0的20mmol/LTris-HCl洗涤.将E.Coli细胞按1︰2悬浮于细胞裂解缓冲液中(50mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA,0.5mmol/LDTT),然后将细菌进行3次冻融和超声破碎至完全裂解.于12000r/min,4℃下离心30min,除去细胞碎片.向红色离心上清液中加入固体硫酸铵使其浓度为30%,搅拌30min后于4℃放置4h使其沉淀完全,4℃,12000r/min离心30min,去除沉淀.再向离心上清液中加入固体硫酸铵至终浓度为60%,离心得红色沉淀.将沉淀物用pH8.5的20mmol/LTris-HCl缓冲液溶解,并对其透析.将透析液于AKTApurifier100快速蛋白纯化系统中依次通过4次层析柱进行纯化:DEAE-Sepharose阴离子交换柱,Hiload16/60Superdex75凝胶过滤柱,Hiprep16/10QFF阴离子交换柱和Hiload16/60Superdex75凝胶过滤柱.其中,离子交换柱用20mmol/LTris-HCl(pH8.5)平衡,0～1mol/LNaCl线性梯度洗脱.凝胶过滤柱用0.1mol/LNaH2PO4-NaHPO4(pH8.0)平衡.上柱前均用其相应平衡缓冲液充分透析蛋白,并用超滤器浓缩.纯化过程中用280和412nm双波长检测流出组分.将纯化后的蛋白对二次水充分透析,冷冻干燥,-20℃保存.(ⅳ)神经红蛋白的谱学初步表征.SDS凝胶电泳采用文献的方法,电泳后用0.25%考马斯亮蓝R-250染色.电喷雾质谱(ESI-MS)由复旦大学蛋白质组学研究中心测定.UV-Vis吸收光谱测量,蛋白溶于20mmol/LTris-HCl(pH7.4)缓冲液,浓度为8μmol/L.还原态蛋白是在氧化态蛋白溶液中加入少许连二亚硫酸钠还原得到.荧光光谱测量,蛋白溶于20mmol/LTris-HCl(pH7.4)缓冲液中,浓度约为12μmol/L.激发光和发射光的狭缝宽度均为5nm,测量激发光谱时固定发射波长为345nm,扫描范围为200～320nm.测量发射光谱时固定激发波长为280nm,扫描范围为295～400nm.圆二色谱的测量,光源系统用氮气保护(流量为5L/min).蛋白溶于100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4),190～250nm扫描时浓度约1.2μmol/L,250～500nm扫描时浓度约24μmol/L.样品池的光径为1cm,测量参数:扫描速率100nm/min,分辨率0.2nm,响应时间0.25s,累积次数10次.(ⅴ)酸度对神经红蛋白稳定性的影响.将0.3mL浓度为60μmol/L神经红蛋白水溶液加到2.7mL不同酸度的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液(pH2.2～7.0)中,室温放置5h,测定紫外可见吸收光谱和荧光光谱.2结果与讨论2.1不同浓度iptg诱导的培养、筛选和基因表达对神经红蛋白基因进行了序列测定,该基因由453bp核苷酸组成,编码151个氨基酸.将带有神经红蛋白基因的pET3a质粒载体转化至E.coliBL21(DE3)plys中,在含氨苄青霉素和氯霉素的TB培养基上进行培养、筛选和基因表达,对实验条件进行了优化.实验表明,用不同浓度IPTG诱导时,在0～1mmol/L浓度范围内,当IPTG浓度大于0.4mmol/L后,其表达量不再随IPTG浓度的增加而增大.由图2中的泳道2可知,神经红蛋白的表达量占细菌总蛋白量的10%左右.另外,实验表明,加入IPTG诱导后用封口膜封口使其隔绝空气,可显著提高神经红蛋白的表达量.不同诱导时间实验表明,诱导时间超过12h后,表达量随时间没有明显变化.温度也是影响NGB表达量的一个因素,低温有利于该蛋白的表达实验表明以25℃为宜.2.2可溶性神经红蛋白的纯化用表达菌进行大量发酵,每升液体TB培养基得到约6g湿菌体.经破菌离心得到蛋白溶液,然后用30%和60%硫酸铵分级沉淀去除部分杂蛋白.NGB用20mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲液溶解后,依次通过离子交换柱和凝胶过滤柱,使其得到进一步的纯化.从图2各泳道中神经红蛋白的含量可以看出,各纯化步骤中NGB的纯度依次增加,最后得到了电泳纯的红色可溶性神经红蛋白.泳道8中单一条带说明蛋白已具有很高的纯度,符合其他分析测试的要求.2.3神经红蛋白的荧光光谱由图2的SDS得NGB分子量约为16.5kD图3为NGB的电喷雾质谱,测定结果为16930.0Da与相应的只有一个二硫键(NGB分子中含有Cys46Cys55和Cys120三个半胱氨酸残基,其中Cys46与Cys55位置较近,可以形成分子内二硫键)的神经红蛋白理论分子量16931.4Da接近,在误差范围内证明了蛋白的正确性.图4是神经红蛋白在20mmol/LTris-HCl(pH7.4)缓冲液中的紫外可见吸收光谱.由图可知,还原态神经红蛋白的吸收峰在425,531和559nm,分别对应于金属卟啉的γ,β和α吸收带,通常又称γ带为Sore带.氧化态的NGB在413nm处有强吸收峰,它对应于金属卟啉的γ吸收带,是电子在卟啉环中非定域化π电子的轨道跃迁(π→π*)的结果,500～600nm间有宽的弱吸收.这与细胞色素b5等含铁卟啉辅基的珠蛋白类似.图5是神经红蛋白在20mmol/LTris-HCl(pH7.4)缓冲液中的荧光光谱.激发谱最大波长为281nm,发射谱最大波长为338nm.神经红蛋白的荧光光谱主要是由其中含有的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)残基产生的.神经红蛋白中含有3个Trp和4个Tyr荧光残基,发射谱最大波长为338nm,说明在NGB中的Trp只有少部分暴露于蛋白分子表面.因为Trp对它所处的微环境的极性很敏感,在不同的蛋白质中其最大发射波长不一样,游离Trp的发射峰位在不同pH值下,在351～361nm范围内变化.图6为神经红蛋白的CD谱,它可分为3个区段远紫外区(190～250nm);近紫外区(250～350nm)可见区(350～500nm).就血红素类蛋白而言,血红素在溶液中本身缺乏手性,但插入蛋白质能提高圆偏振光的吸收.血红素固有手性部分来自蛋白诱导的变形,部分来自血红素邻近可极化基团.血红素类蛋白的铁卟啉光谱吸收的大多数谱带可归属为特殊的电子跃迁.4个极化的平面π→π*跃迁被指认为Q带(470～600nm),B带(380～450nm),N带(300～350nm)和L带(250～300nm).每条谱带对应于一种电子振动结构,这归因于电子与适当对称的振动模式的偶合.所有的跃迁对CD谱都有显著的贡献,对左右圆偏振光有不同的吸收.近紫外区,神经红蛋白在257nm有正峰,278nm有负峰.其中,257nm的峰可归属为卟啉π→π*跃迁L带,278nm的峰为色氨酸和酪氨酸的吸收.可见区,神经红蛋白的吸收比较复杂,351nm的负峰可归属为卟啉π→π*跃迁N带,410nm正峰对应于紫外吸收的Soret带.细胞色素b5在391nm处有一正峰,418nm有一负峰,细胞色素c在405nm处有一正峰,417nm处有一负峰,这与它们六配位低自旋的血红素铁原子有关.当加入变性剂时,第六配体逐渐被取代,血红素铁原子变为高自旋,从而导致405nm峰逐渐增大并略有红移,417nm峰逐渐减小并最终消失.而高铁血红蛋白和肌红蛋白在Soret区仅有一大的正峰.因此可以推断神经红蛋白在测定条件下第六配体可能被溶液中的小分子所取代,410nm的正峰对应于它的六配位高自旋的血红素铁原子.远紫外区,神经红蛋白在222nm处有负峰,208nm处有肩峰,是典型的α-螺旋结构.其中,222nm负峰对应于α螺旋n→π*跃迁,是由构象中较强的氢键作用引起的.208nm负峰对应于α螺旋π→π*跃迁.用JascoJ-810仪器附带的杨氏法计算得二级结构相对含量为:α-螺旋37.2%,β-折叠0.0%,转角31.8%,无规卷曲31.1%.这与晶体结构测定结果相吻合.2.4ph值和添加量对血红素分离的影响当神经红蛋白暴露于酸性溶液中时,紫外光谱中413nm处的Soret吸收峰的吸光度随酸度增加而降低(图7)并蓝移至397nm.经典的酸变性理论认为,当溶液的pH从7.0变至2.0时,由于氨基酸残基的质子化,蛋白质分子将最大限度地带上正电荷,同种电荷间的斥力将导致蛋白质分子去折叠.结合神经红蛋白的分子结构,我们认为,随着溶液pH值的降低,分子间的斥力逐渐增加,同时分子内部的某些氨基酸(如组氨酸等)也会转移至分子表面,使部分肽链暴露于溶剂,引起血红素腔结构的松动.当这种松动超过了分子内其他化学键和次级键的作用时,血红素疏水环境部分或全部破坏,导致血红素的脱出.因此,在紫外可见光谱中观察到Soret带吸收强度的大幅度降低.由图7可以看出,当溶液pH值为4.0,3.8和3.4时,溶液的吸光度反常,各波长的吸光度均有所增加,其中pH为3.4时增加最为明显,同时可以发现蛋白溶液出现浑浊现象(用pI/Mw批量计算[expasy]法算得NGB的等电点为5.42).这可能是由于蛋白在这一pH下生成了一聚集态,从而使溶解度下降引起的这与脱辅基肌红蛋白在2.4mol/L尿素下生成聚集态相类似.图8是神经红蛋白在不同pH缓冲液中的荧