桔皮中橙皮甙的分离及抑菌试验

桔皮中橙皮甙的分离及抑菌试验

柑橘是我国广泛种植的主要水果。它的皮肤可以用作中药，具有理气、健脾、除湿、粘液等的功效。橙皮甙是桔皮的主要活性成分之一,具有治疗高血压、血管硬化及心血管等疾病的功效。据报道,桔皮提取浸膏有较好的抗菌作用,在室温下储存一段时间后仍有一定的抗菌能力。目前,从生物材料中提取天然防腐剂已成为当今世界食品添加剂的一大趋势。为了探明桔皮提取浸膏中抑菌活性的物质基础,本实验以橙皮甙为材料,对常见食品污染菌的抑菌效果进行了研究。1材料和方法1.1试剂与培养基细菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Echerichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis);酵母:汉逊氏酵母(Hansenulasp);霉菌:青霉(Penicilliumsp)、黑曲霉(Aspergillussp)。分别简写为S、E、B、H、P和A,以上菌种由湖北农学院生命科学院微生物实验室提供。牛肉膏、蛋白胨、琼脂为生化级试剂;蔗糖(A.R级)、NaCl(A.R级)、甲醇(A.R级)、HCl(A.R级)、NaOH(A.R级)。以上试剂由湖北省化学试剂公司供货。柱层析硅胶(粒径0.05～0.074mm)、硅胶GF254,均为青岛海洋化工有限公司生产的产品。橙皮甙化学对照品,由中国药品生物制品检定所生产。牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基按文献自制。仪器有FTIR-1730型红外光谱仪,CJ-1680型超净工作台,YSQ.SG41.280型手提式压力蒸汽灭菌锅,HH-6型数显恒温水浴锅,YS2-H型双目生物显微镜,LRH250G型光照培养箱,JA2003型电子天平,ZK-072型恒温干燥箱。1.2红外光谱表征取干桔皮粉30g,10%的氯化钙15mL,5%的偏重亚硫酸钠10mL,10%的氢氧化钠15mL,饱和的氢氧化钙600mL置容器内。水浴加热至50℃保温3h,过滤后滤液用稀盐酸调pH至6～7,冷却放置过夜,抽滤所得的固体物反复用热水洗至淡黄色。将固体物溶于吡啶的甲醇溶液(含吡啶1%)中,以柱层析硅胶为固定相,甲醇为洗脱液,得白色针状晶体。测定熔点为256～258℃。经红外光谱仪测定(KBr压片),其特征吸收峰为:3545cm-1(s、O-H),2945cm-1(w、C-H),1636cm-1(m,C=C),1602cm-1(s、C-O),1100cm-1、1073cm-1(s、C-O-C)。熔点及红外表征数据与文献值相符。将所得的产物溶于甲醇,以硅胶GF254为固定相,甲醇为展开剂,薄层层析只观察到一个点,Rf值为0.87,其结果与用橙皮甙标准品做对照实验的结果一致。1.3无菌试验1.3.1生物指标及培养条件将培养基制成平板,细菌用牛肉膏蛋白胨培养基,酵母及霉菌用PDA培养基。用无菌生理盐水把各种菌种配制成106～107个/L孢子悬液,吸取0.2mL孢子悬液均匀涂抹到灭菌平板上。将浸渍过橙皮甙溶液的滤纸圆片(φ6cm)风干,放到每个涂有菌液的平板上,等距离放3片,每个试验平行6次,文中所列数据为平均值。细菌在37℃下培养24h;酵母及霉菌在28℃下培养48h。测定抑菌圈直径大小,并用无菌水作空白对照(以CK表示),确定抑菌效果。以上操作均在无菌条件下进行。1.3.2以数为基础的社会量表用无菌甲醇将橙皮甙配制成7种质量分数的溶液,各溶液的质量分数分别为0.06%、0.08%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%。将滤纸片置于各质量分数的溶液中浸泡,凉干,放入平板中,测定不同质量分数橙皮溶液的抑菌效果。1.3.3ph对牛肉膏蛋白和pda培养基的制备用Na2HPO4和NaH2PO4配制5个pH梯度的缓冲溶液,pH分别为5、6、7、8、9。并用各种pH缓冲溶液制备牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基。将滤纸片置于质量分数0.5%橙皮甙溶液中浸泡、凉干,放入平板中,测定其抑菌效果。1.3.4抑菌效果测定将橙皮甙置80℃水浴,100℃水浴和121℃湿热条件下,热处理15min后,将在质量分数0.5%橙皮甙溶液浸泡过滤纸片,凉干后置于平板中,测定其抑菌效果。2结果与分析2.1生物指标对甲基霉菌及汉逊氏酵母生长的影响橙皮甙对试验的6种菌的生长均有很强的抑制作用,其中对酵母菌的抑制作用最强。当质量分数为0.5%时,橙皮甙对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉及黑曲霉的生长抑制作用最强;当质量分数为0.7%时,橙皮甙对金黄色葡萄球菌和汉逊氏酵母的生长抑制作用最强。空白样无抑菌作用,见表1。2.2橙皮蚤对6种病原菌生长的影响除金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及大肠杆菌在pH=5时不能生长外,在pH5～9范围内,橙皮甙对6种菌的生长均有一定的抑制作用,见表2。2.3高温处理对橙皮茯苓的抑菌力橙皮甙经3种温度处理15min后,仍具有很强的抑菌力,与未经高温处理的样品对比,两者实验结果无明显变化,说明高