壳聚糖季铵盐的合成及其抗菌性的研究

壳聚糖季铵盐的合成及其抗菌性的研究

壳聚糖是一种环保新材料。它资源丰富，无污染，污染。具有良好的生物适应性和生物可分解性，开发和应用前景。壳聚糖具有广谱抗菌性,已被应用到织物的抗菌整理中。尽管如此,因其在pH大于6.5时很难溶解,限制了它的应用。为了提高棉织品的抗菌保健功能,人们对壳聚糖进行了各种化学改性,得到了无毒的水溶性壳聚糖衍生物。Kim等报道了通过硼氢化钠等先合成席夫碱,再与碘甲烷、氢氧化钠合成碘化三甲基壳聚糖季铵盐。Qin把缩水甘油三甲基氯化铵和壳聚糖合成壳聚糖羟丙基三甲基氯化铵,并做了抗菌实验。但上述实验合成路线复杂、成本高。壳聚糖与碘甲烷、氢氧化钠直接合成三甲基壳聚糖季铵盐的报道及其抗菌性的研究工作却很少。本研究改进了壳聚糖季铵盐的合成方法,并研究了碘化N-三甲基壳聚糖季铵盐的抗菌性能,获得了良好的抗菌效果。1实验部分1.1兰氏阳性菌细菌、革兰氏阴性菌对菌株的选择壳聚糖,市售工业品,脱乙酰度大于90%。其它均为化学纯。细菌包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaure)、革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)、真菌白色念珠菌(Candidaalbicans),由青岛市市立医院提供。1.2实验设备GXZ智慧光照培养箱,宁波东南仪器有限公司;510PFT-IR红外仪,美国Nicolet有限公司。1.3碘甲烷的制备将一定量的壳聚糖与N-甲基吡咯烷酮置于四口烧瓶中,室温分散12h,然后加入一定量的碘甲烷和NaOH的混合溶液,反应过程中N2气保护,反应后将产物在搅拌下缓慢加入到丙酮溶液中,经过滤,乙醇洗涤,真空干燥备用。1.4皮聚糖季铵盐抗菌实验1.4.1最低抑菌浓度测定取适量10mg·mL-1壳聚糖季铵盐水溶液于无菌培养皿中,加入培养基(细菌于营养琼脂培养基中,真菌于马铃薯培养基中,下同)混合均匀,使最终浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mg·mL-1,然后划线接种菌,试样置于生化培养箱(细菌37℃、真菌28℃)中培养(细菌24h、真菌38h),观察菌的生长情况。并以完全无菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)。另外,以未加壳聚糖季铵盐的琼脂试样为对照。1.4.2ph对壳聚糖季铵盐细菌生长的影响用1mol·L-1HCl或NaOH溶液调节培养基的pH值分别为5.4、6.0、6.5、7.0和7.5,取1mL壳聚糖季铵盐溶液于无菌培养皿中,加入9mL培养基充分混合,细菌培养24h、真菌38h,观察菌的生长情况,比较不同pH对测试菌的影响。1.5菌种生长情况的测定取等量菌悬液加入到不同浓度待测样品溶液中,置恒温摇床上150rpm下培养1h,取不同量的混合液涂布在营养琼脂平板上,37℃恒温培养24h后,观察各试样上菌生长情况。无菌生长的浓度为最低杀菌浓度(MBC),计算杀菌率。2结果与讨论2.1壳聚糖—红外光谱分析图1是壳聚糖及其改性产物季铵盐的红外光谱图。从图1中曲线a可看出,壳聚糖在1601cm-1处有较强的吸收峰,这是壳聚糖分子中的—NH2的变形振动吸收峰,而在b曲线中经过改性的壳聚糖的红外光谱中该吸收峰消失,而且出现了1473cm-1和1408cm-1两处吸收峰,并在1374cm-1处也有较明显的吸收峰,这是—N+H(CH3)2或—N+(CH3)3振动偶合使对称弯曲振动裂为强度差别较大的3条谱带。2.2海洋聚糖铵盐菌的性能影响因素2.2.1最适抑菌浓度不同浓度壳聚糖季铵盐的抑菌效果见表1。由表1可看出,随着浓度的增加,抑菌率都有所增强,但对金黄色葡萄球菌的抑菌性最强,最小抑菌浓度(MIC)为1.0mg·mL-1;白色念珠菌次之在1.0mg·mL-1时抑菌率达到了97.5%;浓度为1.25mg·mL-1时,对3种不同菌属抑菌率均达100%。2.2.2壳聚糖季铵盐的抑菌效果pH对壳聚糖季铵盐抑菌性能影响见图2。由图2可看出,在未添加壳聚糖季铵盐时,菌落数随着pH的增高而增多,即在碱性条件下有利于细菌的生长。而添加壳聚糖季铵盐后,试样上的菌落数随着pH值的增加而减少。说明壳聚糖季铵盐在碱性条件下具有更强的抑菌性能。这是因为在中性及弱碱性环境中,细菌蛋白质带有更多的负电荷,增加了与壳聚糖季铵盐之间的相互作用,所以在弱碱性条件下具有更强的抑菌活性,这与普通季铵盐消毒剂的规律相吻合。2.3细菌抑菌和添加细菌壳聚糖季铵盐的杀菌性见图3。可看出,壳聚糖季铵盐随着浓度的增加杀菌率升高,但杀死细菌的效果不如抑菌效果显著,且用量多。在浓度为7.5mg·mL-1时,对金黄色葡萄球菌的杀菌率可达到100%;浓度为10mg·mL-1时,对大肠杆菌的杀菌率达到了100%。2.4壳聚糖季铵盐的抑菌作用壳聚糖及其衍生物的抗菌机理比较复杂,但总的来说,主要是由于破坏了细菌细胞质膜的正常生长,从而起到了抗菌作用。因壳聚糖本身是阳离子大分子聚合物,可与细胞表面带有负电荷的的蛋白质、磷壁酸、脂多糖等发生絮凝作用,破坏细胞质膜的渗透屏障作用,导致细胞的完整性破坏,营养物质流失,达到抗菌作用;或吸附带有负电荷的细菌,干扰细胞壁的合成,使细胞壁溶解而死亡。由此可见,壳聚糖季铵盐的抑杀菌作用,主要作用目标位点是细菌的细胞质膜,使细胞膜丧失了屏障作用,故壳聚糖季铵盐有强的抑菌活性,而杀菌活性较低。壳聚糖季铵盐对金黄色葡萄球菌的抗菌活性更加明显。金黄色葡萄球菌是典型的革兰氏阳性菌,革兰氏阳性菌的细胞壁是由磷壁酸组成。而革兰氏