多聚磷酸盐抑菌活性的研究

多聚磷酸盐抑菌活性的研究

采用多聚磷酰钠作为保水剂和质量改良剂，在水和食品加工中得到广泛应用，保持水的补充和改善口的颜色，增加重量。多聚磷酸盐会促进血液凝结,其降解产物磷酸盐也会增大摄入者心脑血管疾病发生的可能性,因此,欧盟等国对进口虾仁有限量要求(5g/kg)。另据研究表明多聚磷酸盐具有抑菌作用,近几年我国出口虾仁多次被通报抑菌剂超标,主要是由添加抑菌剂多聚磷酸盐所致。因此如何突破欧盟抑菌剂技术壁垒成为水产出口企业关注的新问题。微生物法的样品前处理简单、操作简便、灵敏度高,在一定范围内有良好的剂量-抑菌关系,被广泛应用于抗生素的抑菌效果检测。枯草芽孢杆菌既对抗革兰氏阳性菌药物敏感,又对抗革兰氏阴性菌药物敏感,同时还有芽孢的特性,能耐受高温、干燥和渗透压的影响,因此具有较好的稳定性、安全性,对环境及人畜无污染。滕黄微球菌对多种药物具有较好的敏感性。此外,不同pH值培养基影响药物敏感性。因此,本实验以枯草芽孢杆菌和滕黄微球菌作为目标敏感菌,通过微生物法研究多聚磷酸盐主要成分正磷酸盐、三聚磷酸盐、三偏磷酸盐和焦磷酸盐在不同pH值培养基上的抑菌效果。1材料和方法1.1药品化学品检测枯草芽孢杆菌(ATCC6633)、滕黄微球菌(ATCC9341)中国药品生物制品检定所。检测琼脂(pH6.0)、检测琼脂(pH7.2)、检测琼脂(pH8.0)德国Merker公司;营养琼脂北京陆桥公司;标准品:正磷酸盐、三聚磷酸盐、焦磷酸盐、三偏磷酸盐Sigma公司。1.2高速冷冻离心设备BK-6160培养箱、FISHER-LEGENDMACH1.6R高速冷冻离心机Thermo公司;MSI涡旋混合仪德国IKA公司;LDZX-50KBS高压灭菌锅上海申安医疗器械厂;LogicA2生物安全柜美国Labconco公司。1.3方法1.3.1芽孢杆菌芽孢的制备枯草芽孢杆菌悬液制备:将枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面培养物用适量灭菌生理盐水洗涤菌苔,制成悬液,用吸管将此悬液接种于盛有100mL普通营养琼脂培养基的克氏瓶中,在35~37℃条件下培养,镜检芽孢数达85%以上停止培养。用40mL灭菌生理盐水洗下菌苔,制成悬液,65℃水浴加热30min将菌体杀死,经3000r/min离心20min,弃去上清液,如此重复洗涤芽孢两次,然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液。置2~8℃冰箱中保存。滕黄微球菌悬液制备:取滕黄微球菌的营养琼脂斜面培养物,用适量的灭菌生理盐水洗涤菌苔,制成悬液,用吸管移至盛有营养琼脂培养基克氏瓶中,26~27℃培养18~24h后,用灭菌生理盐水洗下菌苔,制成菌悬液。置2~8℃冰箱中保存。Bs6平板:将枯草芽孢杆菌孢子悬浮液接种至pH6检测琼脂液中,调节浓度为5×104个孢子/mL琼脂。取5mL被接种过的琼脂液倒在平板上,备用。Bs7.2平板:将枯草芽孢杆菌孢子悬浮液接种至pH7.2检测琼脂液中,调节浓度为5×104个孢子/mL琼脂。取5mL被接种过的琼脂液倒在平板上,然后放在冷的平板上冷却,备用。Bs8平板:将枯草芽孢杆菌孢子悬浮液接种至pH8检测琼脂液中,调节浓度为5×104个孢子/mL琼脂。取5mL被接种过的琼脂液倒在平板上,然后放在冷的平板上冷却,备用。MI8平板:将滕黄微球菌孢子悬浮液接种至pH8检测琼脂液中,直至浓度为5×104个孢子/mL琼脂。5mL被接种过的琼脂液倒在平板上,然后放在冷的平板上冷却,备用。1.3.2抑菌圈测定每一个样品准备Bs6、Bs7.2、Bs8和MI8四个平板,每一个平板上放置直径为6mm的两张纸片。吸取10μL试剂加在纸片上,在室温(25℃左右)放置10min,以便使供试样液能扩散至培养基。Bs6、Bs7.2、Bs8平板(30±1)℃培养(20±2)h以及MI8平板(36±1)℃培养(26±2)h后用游标卡尺测量出现的抑菌圈的宽度。同时在滕黄色微球菌平板上加红霉素标准纸片(0.0025μg/片)做阳性对照,在枯草芽孢杆菌上加卡那霉素标准纸片(0.05μg/片)做阳性对照,6mm标准空白纸片加10μL无菌水做阴性对照。如果抑菌圈的宽度大于2mm则认为抑菌剂阳性。如果结果可疑(同一样品的检测结果为一个阳性,另一个阴性),实验必须重复,如果第二次实验仍然可疑,则判为阴性。1.3.3抑菌效果检测将正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐配制成0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、10.0g/100mL不同质量浓度,根据抑菌剂检测方法分别进行抑菌效果检测,以空白作对照,测定抑菌圈宽度。1.3.4焦磷酸盐质量浓度的核算三聚磷酸盐质量浓度以P2O5计的换算公式:M/367.86×141.94×3/2焦磷酸盐质量浓度以P2O5计的换算公式:M/265.90×141.94×2/2式中,M:如质量浓度0.2g/100mL,换算为2000mg/kg,M即为2000。1.3.5焦磷酸和三聚磷酸钠联合使用对抗菌效果的影响对三聚磷酸盐和焦磷酸盐进行两因素三水平的正交试验设计,研究其对抑菌效果的影响。2结果与分析2.1检测结果分析对水产品添加剂的单一成分,包括正磷酸盐、三聚磷酸盐、焦磷酸盐和三偏磷酸盐,进行抑菌效果检测,结果见表1~4。正磷酸盐、偏磷酸盐产生抑菌效果时的质量浓度太高,在实际加工中不用。因此,虾仁产生抑菌剂是多聚磷酸盐中三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果产生的。在三聚磷酸盐和焦磷酸盐的质量浓度分别为0.2、0.3g/100mL时,产生抑菌圈宽度为2.0mm。2.2抑菌效果临界测试通过对三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果检测发现,质量浓度分别为0.2g/100mL和0.3g/100mL时,在Bs7.2平板上产生宽度为2mm的抑菌圈。因此选择Bs7.2平板研究三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果临界测试、结果见表5。三聚磷酸盐和焦磷酸盐的质量浓度分别为0.2g/100mL和0.3g/100mL时,均可产生2.0mm抑菌圈。出口虾仁多聚磷酸盐的检测结果是以五氧化二磷含量计算的。因此,本研究将三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果临界质量浓度换算为以五氧化二磷计。这两种盐的抑菌效果临界值以P2O5计分别为1157.56mg/kg和1601.43mg/kg。2.3磷酸盐、焦磷酸盐的质量浓度对抑菌圈的影响不同焦磷酸盐和三聚磷酸质量盐浓度有不同的抑菌效果,为了分析两种磷酸盐不同质量浓度配比对抑菌效果的影响,选取了3个不同质量浓度在Bs7.2平板上进行正交试验,各因素水平见表6。从表7可以得出,三聚磷酸盐的质量浓度为0.4g/100mL、焦磷酸盐的质量浓度为0.6g/100mL时,其抑菌效果最强,抑菌圈宽度为5.6mm;三聚磷酸盐的质量浓度为0.2g/100mL、焦磷酸盐的质量浓度为0.3g/100mL时,抑菌圈宽度为2.3mm,即两者同时作用时,抑菌圈并非会成倍增长,而是在单独作用的基础上有所增强;三聚磷酸盐质量浓度为0.2g/100mL,焦磷酸质量浓度为0.15g/100mL时,产生2.0mm抑菌圈;三聚磷酸盐质量浓度为0.1g/100mL、焦磷酸盐质量浓度为0.3g/100mL时,产生2.2mm抑菌圈,表明当二者有一种质量浓度达到临界浓度,就能产生抑菌阳性作用。3多聚磷酸盐抑菌效果目前,对于多聚磷酸盐已有较多的研究,但国内的研究大多是基于其对肉品质的改善或用离子色谱法测定含量,国外已有针对多聚磷酸盐对金黄色葡萄球菌以及蜡状芽孢杆菌抑菌效果的研究,但没见多聚磷酸盐对枯草芽孢杆菌以及滕黄微球菌抑菌作用的相关报道。本实验选用了两种微生物法常用菌种,并考虑到培养基pH值对抑菌效果的影响,采用了四平板法对多聚磷酸盐抑菌效果进行研究。结果表明,Bs7.2平板上磷酸盐的抑菌效果最为明显,其他平板上只有三聚磷酸盐和焦磷酸盐在高质量浓度情况下才表现出抑菌作用。对多聚磷酸盐的4种主要成分抑菌效果研究发现,主要抑菌成分为三聚磷酸盐和焦磷酸盐。通过进一步研究表明,在质量浓度分别为0.2g/100mL和0.3g/100mL时,产生2mm抑菌圈,即抑菌效果呈阳性。表明当二者有一种质量浓度达到临界浓度,就能产生抑菌剂阳性作用。将三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果临界质量浓度换算为以五氧化二磷计分别为1157.