缓释型无机抗菌材料抑菌圈测试方法的研究

缓释型无机抗菌材料抑菌圈测试方法的研究

1抗菌性能测定随着人们生活水平的提高，对环境和自身健康和健康卫生的要求也越来越高。许多科技工作者都致力于开发各种无机抗菌材料,如抗菌陶瓷、抗菌玻璃、抗菌纤维和抗菌涂料等。尽管目前已有许多抗菌方面的专利和产品问世,但由于各种无机抗菌剂的有效成分、抗菌机制和具体用途不尽相同,所以尚未有一种统一规范的测试方法来评价无机抗菌材料的抗菌性能,使得不同方法测得抗菌指标的横向可比性较差。借鉴微生物检验法,根据抗菌材料的亲(疏)水性、所用抗菌剂的溶出性以及抗菌材料的外在形态,对抗菌材料抗菌性能测定的常用方法有抑菌圈法、薄膜密贴法、最小抑菌浓度法和细菌总数测定法等。最近,徐瑛等根据细菌在生长代谢过程中会发生热量变化,提出微热量法检测抗菌材料的抗菌性能。其中抑菌圈法是一种常用的定性抗菌性能测试方法。虽然最终都是采用抑菌圈直径来表征抗菌材料的抗菌性能(抑菌圈直径越大,抗菌效果越好),但其具体测试过程差别较大。这主要表现在以下两个方面:(1)试验细菌悬浮液的引入方式不同,有营养培养基表面平铺法和混入营养培养基法。(2)抗菌样品测试形态不同,有采用抗菌材料粉末或压成片状直接放在培养基表面,有先放置钢圈,再滴加入抗菌材料悬浮液,或采用圆形滤纸片浸渍抗菌材料的悬浮液,再放置于培养基表面。为规范抑菌圈法测试过程和控制影响测定结果的干扰因素,更准确地评价抗菌材料的抗菌性能,本文针对一大类缓释型无机抗菌材料,依据其抗菌机制和抑菌圈法的基本原理,着重探讨粉末抑菌圈测定法的影响因素,并进行试验研究。2粉末抗菌圈法2.1柱、杯、石棉、网、水无菌箱、培养皿、玻璃环、镊子、接种针、酒精灯、玻璃棒、铁质圆柱、烧杯、电炉、石棉网、托盘天平(附砝码)、加料漏斗、量筒、胶头滴管、喷雾器、直尺、营养琼脂、去离子水和双氧水。粉末试样采用载银型钠硼硅酸盐玻璃,其化学组成和制备方法详见文献。2.2测试步骤2.2.1喷雾器喷入双氧水、杀菌实验室预先密闭用双氧水雾杀菌;无菌箱经擦洗干净后,用喷雾器喷入双氧水密闭消毒、杀菌;培养皿、镊子、玻璃杯、玻璃棒、加料漏斗、量筒等经清洗后放入电热恒温干燥箱烘干杀菌;测定操作时尽量保持室内空气不流动。2.2.2试验中的细菌悬浮液按无菌操作要求,将培养好的枯草杆菌斜面,用无菌生理盐水刮洗下来,并充分振荡以分散菌体。2.2.3枯草杆菌悬浮液的制备将加入一定比例去离子水的营养琼脂培养基(4g琼脂/50mLH2O)放在电炉上溶化、灭菌,稍冷后(50～60℃)按无菌操作要求把预先制备的枯草杆菌悬浮液混入并充分摇匀,然后立即倒入无菌培养皿中(每皿15mL左右),迅速旋动,后静置水平位置冷凝(要求表面光滑平整、厚薄均匀)。2.2.4玻璃环的制备用托盘天平称取一定颗粒度(0.32～0.21mm)的粉末试样1g,用镊子将玻璃环(内径为1.8cm)轻轻放置培养皿内平板中央,并轻轻压实,以防止倒入粉末压实时从底部挤出,然后通过加料漏斗把粉末试样加入到玻璃环中,并用玻璃棒拨匀、捣实(以不破坏琼脂平板为宜)。2.2.5温室下培养盖好皿盖,置于无菌箱内室温培养24h。2.2.6观察测量取出观察,按互成45℃的4个直径方向测量透明抑菌圈直径,计算平均值。3影响粉末试样质量的因素根据粉末抑菌圈法的基本原理及其操作步骤,其可能的影响因素有粉末试样质量m、玻璃环直径do、粉末试样颗粒度、粉末试样在玻璃环中堆积的密实程度和营养琼脂培养基的水分含量等。通过试验,定量测定各因素对抑菌圈直径的影响程度。3.1抗菌玻璃粉末试验中所用粉末试样均能铺满玻璃环范围内的琼脂平板面,结果如图1所示。从图1可以看出,在24h培养时间内,所用粉末试样的多少并不明显地影响抑菌圈直径大小。这是因为营养琼脂培养基中所含水分少,而且在试样质量波动范围内,最小质量的试样亦能铺满玻璃环内琼脂平板面并堆积一定高度。抗菌玻璃粉末是通过浸吸培养基中水分来释出银离子,然后在培养基内扩散使检验菌不能生长繁殖而出现透明抑菌圈的。由于该抗菌玻璃材料的银离子释放速度较稳定,因而在短时间内实际提供银离子的试样量是相同的。因此,抑菌圈直径变化不明显,仅出现稍微波动。后者是由于随着粉末试样的增多,在用玻璃棒捣实过程中,实际受侵蚀的粉末堆积紧密程度可能不一致所致。总之在玻璃环直径一定的情况下,所用粉末质量只要能够铺满玻璃环内琼脂平板即可,再增加粉末试样质量并不能增大其抑菌圈直径。3.2抑菌圈直径的影响如图2所示,随着玻璃环直径的增大,抑菌圈直径也随之增大。粉末试样质量相同的情况下,最大的玻璃环也能保证粉末试样铺满环内平板,所以,随着玻璃环直径的增大,与培养基直接接触的试样和在短时间内实际能释放银离子的试样量逐渐增大,因而抑菌圈直径增大。因此,为了减少测量误差,在测定实验中宜采用较大玻璃环(2.0～4.0cm),这有利于增大粉末抗菌材料的抑菌圈直径,但所用粉末必须能够铺满环内琼脂平板。3.3抑菌圈直径的变化如图3所示,随着粉末颗粒度的减小,抑菌圈直径逐渐增大。这是因为粉末颗粒度减小,比表面积增大,即水分对玻璃粉末的浸蚀作用面积增大,使之在同样时间内能释放出更多银离子,因而其抗菌能力增强,表现出抑菌圈直径增大。但粉末颗粒度太大(筛网<0.64mm)或太小(筛网>0.25mm),其抑菌圈直径变化较大。因此,为了减小实验系统误差,抗菌材料粉末宜筛取0.64～0.25mm间颗粒进行抗菌性实验。3.4堆积与温度试验结果如图4所示。从图4可看出,在自然堆积状态下,抑菌圈直径较小,而用铁质圆柱夯实的情况下,抑菌圈直径较大。这是因为在密实过程中,堆积越紧密,夯入琼脂平板的粉末越多,因而在短时间能有效提供银离子的粉末量就越多,抑菌圈直径增大。同时堆积越紧密,越容易形成连通毛细管来抽吸水分,使更多的抗菌玻璃粉末试样受到浸蚀,释放出较多的银离子,从而也促使抑菌圈直径增大。因为采用铁圆柱体夯实易破坏玻璃环内琼脂平板,且操作难度增大,因此宜采用玻璃棒将玻璃环内粉末试样进行适当捣实。3.5培养基银离子检测图5中曲线表明,随着培养基中水分增多,抑菌圈直径几乎呈直线增大。这是由于:一方面,培养基水分增多,使得玻璃环中实际受浸蚀的粉末量增大,在同样短时间内能够释放出更多的银离子;另一方面,培养基水分增多,银离子在培养基中的扩散系数增大,使得银离子易于在培养基中扩散,抑菌圈扩大。同样地,琼脂培养基中水分太多(营养琼脂含量<4g/10mLH2O)或太少(营养琼脂含量>8g/100LH2O)都将使抑菌圈直径变化较大。因此,为了减小实验系统误差,琼脂培养基中水分宜在4～8g营养琼脂/100mLH2O范围内。4玻璃环内粉末抗菌性实验采用粉末抑菌圈法能简便、较准确地评价无机抗菌材料的抗菌效果。该测定方法具有较高的灵敏性,重复性也较好。从试验结果可知,为了减小测定实验的操作和系统误差,应通