菌种安全管理制度

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2、菌种应保存于安全的地方，所用冰箱等保存容器均应加锁，若要运输或携带必须置于金属罐内密封，由专人领取。

3、建立严格使用登记制度。

（1）所有菌种须按种类、来源、数量购买时期一一登记入册。

（2）使用时须使用者签字，主任审批。

（3）实验菌种使用完毕须高压来菌处理并作好销毁记录。

4、保存的菌种应于规定时间定期移种。

5、培养菌种的试管和干燥菌种的安瓿上应贴标签，写明编号，菌名及日期。

6、菌种不得外借，不得随便带出实验室。

7、菌种保存范围，转移和销毁等必须严格遵守卫生部有关规定，主任不定期检查，核实菌种使用销毁情况。

第二篇：菌种驯化工程的调试、运行与管理第一节菌种驯育与启动

一、厌氧培菌与启动1.选取菌种（污泥）

用于厌氧发酵罐启动的厌氧活性污泥叫接种物。沼气发酵过程是多种类微生物共同作用的结果，要注意接种物的产甲烷活性，因为产酸菌繁殖快，而产甲烷菌繁殖很慢，如果接种物中产甲烷菌（活性污泥）数量太少，常常因为在启动过程中酸化与甲烷化速度的过分不平衡而导致启动的失败。

在确定系统运行温度后，要选择同类工程的活性污泥做接种物（菌种）。是否是相同的菌种，或富集菌种的多少，决定系统启动速度的快慢。由于各地具体条件差异，监测手段不同，启动时的操作方式也不会是一个模式，只能是类似。条件具备的地方，处理同类废水，接种同类污泥，以保持厌氧微生物生态环境的一致。当地不具备这样的条件，需要在驯化上下工夫，启动的时间要长些，速度会慢些。厌氧发酵罐排出的活性污泥和污水沟底正在发泡的活性污泥，都可作为选取接种物的对象。接种量约占发酵容积的1/10~1/3，接种量越多，启动速度越快，在此基础上逐渐富集。

2.菌种的驯化与富集

菌种的驯化富集可在新建的发酵罐内进行，也可在其他的容器内进行。取来的厌氧活性污泥（菌种）越多越好，再加入适量的处理原料（数量小于菌种数量的10%份额）。菌种和原料的混合液在装置内作好保温，再逐渐升温（如果是中温或高温运行，要逐渐升温到35~54℃），并调节ph在6.8~7.2范围。每隔1~2天加入新料液一次，数量仍为装置内料液的5%~10%份额，以此继续下去。驯化富集过程，是为厌氧发酵创造必要的条件，首要条件是适宜的温度和ph，每次加入新料液的多少也是由驯化富集起来的菌种液ph的高低所确定。

3.沼气发酵启动

沼气发酵的启动是指从投入接种物和原料开始，经过驯化和培养，使发酵罐中厌氧活性污泥的数量和活性逐步增加，直至发酵罐的运行达到设计要求的全过程。这个过程所经历的时间成为启动期。沼气发酵罐的启动一般需要较长时间，若能取得大量活性污泥作为接种物，在启动开始时投入发酵罐中，可缩短启动期。把富集的菌种投入到发酵罐内，对于较小容器的发酵罐，菌种量约占总容积的1/3；较大容积的发酵罐，富集的菌种可以适当小于容积的1/3。然后按正常运行状态封闭发酵罐，接通全系统，使富集的菌种逐步升温到系统的运行温度。中温运行的系统，升温到35℃±1℃；高温运行的系统，升温到54℃±1℃。目前，对菌种升温速度持有不同观点，一种观点是采用间断升温办法，每次升温2~3℃，接着稳定2~3天，然后重复进行，直至升温至35℃或54℃。另一种观点是主张快速升温，每小时升温1℃。

在启动运行时，要装备监测手段，特别是对食品工业废水，要求达到排放标准。简单的做法是控制好发酵料液的温度和ph在最佳范围之内。有条件应以监视挥发酸含量代替监控ph，还应监测排出液的cod含量、去除率及沼气发酵罐的消化负荷。启动运行阶段cod去除率要适当放宽，以满足最佳ph要求。无论是哪种类型的发酵装置，其启动方式都是将接种物和首批料液投入发酵罐后，停止进料若干天。在料液处于静态下，使接种污泥暂时聚集和生长，或者附着于填料表面。待大部分有机物被分解去除时，即产气高峰过后，料液的ph在7.0以上，或产气中甲烷含量在50%以上或cod去除率达到80%左右时，再进行连续投料或半连续投料运行。

每次进料要在预处理阶段升温到高出系统运行温度3~5℃，并使新料液ph调节到6.5~7范围内，每次进料量是发酵罐内料液的5%~10%，进料量的多少，由发酵罐内的料液ph高低来确定。每隔1~2天进料一次，直至发酵罐内的料液向外溢流，这为该系统启动的第一阶段。此后，逐渐缩短每次进料间隔，逐渐增加进料量，直至通过实践得出每天的最大进料量，并能满足发酵罐正常运行。如果是达标排放的环保工程，还要满足cod去除率的指标，同时也可以得出发酵罐的最大消化负荷，也就是每天每立方米发酵容积能消化多少千克cod，用kgcod/（m3od）表示。

在启动过程中，最常见的障碍是负荷过高所引起的发酵液有机酸含量上升、ph降低；这会引起污泥沉降性能差而严重流失。排除的方法为：首先应停止进料，待ph恢复正常后，再以较低负荷开始进料。当发现ph已经降至5.5以下，需要添加石灰水、碳酸钠、碳酸氢钠等碱性物质进行中和。同时也可排出部分发酵液，再加入一些接种物，以起到稀释、补充缓冲物质和增加活性污泥的作用。

4.uasb启动和颗粒污泥

uasb的启动最大困难时获得大量性能良好的厌氧活性污泥。最好的办法是从现有的厌氧处理设备中取出大量污泥投入消化器进行启动，如有处理相同废水的污泥则效果更好。

启动时应注意，最初污泥负荷应低于0.1~0.2kgcod/（kgvssod），根据挥发酸数值，再逐步提高负荷。

在uasb内虽设有三相分离器，但出水中仍带有一定数量污泥，特别是在工艺控制不当时，常会造成大量跑泥。在正常运行时，少量活性污泥会因进水中的悬浮固体或气泡的夹带而随水冲出。污泥过满，也会使出水中污泥增多，这时应及时排放剩余污泥。在冲击负荷的条件下，可能导致污泥过度膨胀，也可大量流失污泥。

uasb的成功运行，使得消化器内形成了一种主要由厌氧消化细菌和胞外多聚物构成的微生态颗粒，人们称它为颗粒污泥。颗粒污泥的形成是厌氧消化过程的一个新发现，它实际上是沼气发酵微生物的天然固定化颗粒。在每个成熟的污泥颗粒内生活着厌氧消化生态系所必须的各种微生物类群，胞外多聚物填充于细菌之间并包围于颗粒表面，使每个污泥颗粒成为一个独立的渗透性实体。各种营养物质经过胞外酶水解后，通过渗透作用进入颗粒内供厌氧消化细菌生长繁殖，细菌之间按其食物链关系将其代谢产物互相传递，并将其终产物通过渗透作用从颗粒中排出。这样，颗粒中的每个细菌都成了这个微生态系的一员，它们与外界环境的接触都通过这个系统进行。因而对每个细菌来说，生活条件都相对稳定，使颗粒污泥对环境条件的变化具有更大的适应性。

颗粒污泥的形状大小不一，直径在0.2~5mm之间，但成熟的颗粒污泥直径多在2~3mm之间，形状多为近球形。

二、好氧活性污泥驯育与启动1.培菌

在活性污泥的培养与驯育期间，必须满足微生物生命活动所需的各种条件，而且要求尽量理想化。一是保证足够的溶解氧和保持营养平衡，对于缺乏某些营养物质的工业废水，要适量投加一些营养物质。二是水温、ph值要尽量在最适范围内，且没有大的波动。三是有机负荷要由低而高、循序渐进。培养期间，每隔8小时要对混合液的污泥浓度、污泥指数、溶解氧含量等进行分析化验，同时还要检测进出水的bod、cod及ss等指标，根据检测结果及时加以调整。

（1）间歇培养法

间歇培养法是将污水注满曝气池，然后停止进水，开始闷曝（只曝气而不进水）。闷曝2~3天后，停止曝气，静止1~1.5小时，然后再进入部分新鲜污水，水量约为曝气池容积的1/5即可。以后循环进行闷曝、静止沉淀、进水三个过程，但每次进水量应比上次有所增加，而每次闷曝的时间应比上次有所减少，即增加进水的次数。

当污水的温度在15~20℃时，采用这种方法经过15天左右，就可使曝气池中的污泥浓度超过1g/l以上，混合液的污泥沉降比（sv）达到15%~20%。此时停止闷曝，连续进水连续曝气，并开始回流污泥。最初回流比应当小些，可以控制在25%左右，随着污泥浓度的增高，逐渐将回流比提高到设计值。

（2）连续培养法

连续培养法是使污水直接通过活性污泥系统的曝气池和二沉池，连续进水和出水；二沉池不排放剩余污泥，全部回流曝气池，直到混合液的污泥浓度达到设计值为止的办法。具体做法有以下三种。

a.低负荷连续培养。将曝气池注满污水后，停止进水，闷曝1~2天。然后连续进水连续曝气，进水量控制在设计水量的1/2或更低，不排泥也不回流。等曝气池形成污泥絮体后，开始以低回流比（25%左右）回流污泥。当混合液污泥浓度超过1g/l后，开始以设计回流比回流污泥。当混合液的污泥浓度接近设计值时，可根据具体情况适量排放剩余污泥。

b.高负荷连续培养。将曝气池注满污水后，停止进水，闷曝1~2天。然后按设计流量连续进水连续曝气，等曝气池形成污泥絮体后，开始以低回流比（25%左右）回流污泥。当混合液的污泥浓度接近设计值时，可再根据具体情况适量排放剩余污泥。

c.接种培养。将曝气池注满污水后，投入大量其他污水处理厂的正常污泥（最好是没有经过消化的新鲜脱水剩余污泥），再按高负荷连续培养法培养。接种培养能力大大缩短污泥培养时间，但大型处理厂需要的接种量非常大，运输大量污泥往往不太现实，所以此法一般只适用于规模较小的污水处理厂。当污水处理厂改建或扩建时，利用旧曝气污泥为新曝气池提供接种污泥，是常用的做法。当新建污水处理厂有多个系列的曝气池、附近又没有污水处理厂可以提供接种污泥时，可以先在一个系列利用上述方法成功培养污泥后，再向其他系列曝气池提供接种污泥，从而缩短全场的培养时间和降低培养的能耗。

2.活性污泥的驯化

活性污泥的驯化通常是针对含有有毒或难降解的有机工业废水而言。一般是预先利用生活污水或粪便水培养活性污泥，再用待处理的污水驯化，使活性污泥适应所处理污水的特点。经过长期驯化的活性污泥甚至有可能氧化分解一些有毒有机物，甚至将其变成微生物的营养物质。驯化的方法可分为异步法和同步法两种，两种驯化法的结果都是全部接纳工业废水。

a.异步驯化法是用生活污水或粪便水将活性污泥培养成熟后，再逐步增加工业废水在混合液中的比例。每变化一次配比，污泥浓度和处理效果的下降不应超过10%，并且经过7~10天运行后，能恢复到最佳值。

b.同步驯化法是用生活污水或粪便水培养活性污泥的同时，就开始投加少量的工业废水，随后逐渐提高工业废水在混合液中的比例。对生化性好、有毒成分较少、营养也比较全面的工业废水，可以使用同步驯化法同时进行污泥的培养和驯化。否则，必须使用异步驯化法将培养和驯化完全分开。第二节工程厌氧-好氧系统的运行和管理

一、厌氧消化系统的运行管理

启动后，厌氧消化系统管理的基本要求，在于通过控制各项工艺条件，使厌氧装置稳定运行。只有稳定运行的消化器才会有高的运行效果。不稳定情况的出现，常常由于操作人员在控制上的疏忽，如进料量过多或过少，温度骤然升高或下降等；或因控制条件以外的原因，如停电、停水、进水浓度大幅度波动，进水中混入强酸、强碱、农药、抗菌素等有毒物质。因此，除日常运行坚持正确控制各种运行条件外，还要随时注意消化器内酸化和甲烷化的平衡，及早发现出现的问题，并迅速予以纠正。

1.酸化和甲烷化的平衡酸化和甲烷化的失调，主要是因为酸化细菌的繁殖速度远远高于甲烷化细菌的繁殖速度。失调的具体表现是：发酵液挥发酸浓度升高，ph下降；沼气产量明显减少，沼气中的co2含量升高，ch4含量下降；出水cod浓度升高，悬浮固体沉降性能下降。上述三个方面如能经常检查，均可较早发现不平衡现象的出现。经验表明，测定有机酸的组成，可以预报可能发生的事故。如果有机酸不断上升，就预示着设备超负荷，这就应该采取相应措施，如果控制有机负荷后，短期内消化作用恢复正常，说明不平衡主要由超负荷所引起。如果控制并调节ph后，消化作用仍不正常，则应检查进料中是否含有有毒物质。

2.污泥浓度的调节

厌氧消化器内保持足够的污泥量，是保证消化器运行效率的基础，但经长时间运行后，污泥持留量过度时，不仅无助于提高厌氧消化效率，相反会因为污泥沉积使有效容积缩小而降低效率。或者因易于堵塞而影响正常运行，或者因短路使污泥与原料混合情况变差，使出水中带有大量污泥。因此，当消化器运行至一定时间后就应及时、适量地排泥，使污泥沉降的上平面保持在溢流出水口下0.5~1.0m的位置，这样既可保证水力运行的畅通，又可使悬浮污泥有沉降的空间。排泥的方法多从底部排泥管排出，由于无活性的沉渣和少量泥砂沉淀于消化器底部，长期堆积占据消化器空间而无功效，应经常将其排出。一般每隔3~5天排放一次，每次排放量应视污泥在消化器内积累高度而定。如果长期不排除沉淀污泥，会使排泥管堵塞，特别是在进行薯干酒精废液沼气发酵时，一旦泥砂沉积造成排泥管堵塞，再想排泥十分困难。启动阶段，沼气池内污泥量不足时，排出的污泥经沉砂后可回流入沼气池内。

3.搅拌的控制

搅拌的目的主要是为了增加微生物与原料的接触，在厌氧消化器内，由于进料的冲击及所产生沼气的逸出形成一些搅拌作用。因此，在厌氧消化过程中一般不需连续搅拌，在升流式消化期内一些沉降性能良好的原料，则不需要搅拌，一些易悬浮生成结壳的原料需每天定时搅拌几次打破结壳，并使浮渣逐渐分解而沉降。uasb不需要搅拌，usr如无浮渣结壳现象也不需要搅拌，一些常规消化器一般不需要连续搅拌，特别是在出料时应尽量使发酵原料保持自然沉降状态，这样可以延长srt和mrt因而获得较高的消化率。

4.停运与再启动因检修或季节性生产等原因，厌氧发酵装置可能会有一段时间停运，这种停运对厌氧消化性能的保持并无大影响。因而在停运条件下，厌氧污泥的活性可以保持一年或更长的时间。

在停运期内，应使消化器内发酵液的温度保持在4~20℃。据观察，在此温度范围内保存的污泥，重新启动时经3~7天就可恢复到原有的性能；如果在3℃以下恢复的时间就会延长到7~10天，倘若在接近冰点的温度下保存污泥，则会使污泥性能受到影响，待消化器在启动时，就不能在短期内恢复到原有的效能。此外，在停运期间，还应设法使出料口及导气管等保持封闭，以维持消化期内的厌氧状态。

停运后的消化器再启动时，一般只需恢复消化器的运行温度，并根据运行状态逐步提高负荷，则在较短时间内就能达到停运前的效能水平。

二、维修与安全

大型沼气工程及所有附属机械设备、计量仪表和电器除临时维修外，都应当分别有维修周期。按规定周期进行大修，不应当等到出现故障或设备损坏再突击修理。大型沼气工程每隔3~5年有计划地检修一次，事先应做好存放厌氧活性污泥的准备，以便检修后及时将污泥泵回沼气池内，可缩短大修后再启动的时间。大修时应将污泥、浮渣、沉渣和底部泥砂清扫干净，进行防腐、防渗、防漏处理，最后按沼气池试用验收合格后，才能重新装入污泥继续进行。检修进入应特别注意安全：

①检修人员进池前，必须打开消化器的所有孔口，用鼓风机连续吹入新鲜空气8h以上，测定池内空气中的甲烷、h2s、co2和o2含量合格后方可进入。也可用动物实验，确保操作人员的安全。

②检修人员进池应戴防毒面具、戴好安全帽、系好安全带及安全绳，池外必须保护，整个检修期间不得停止鼓风。

③池内所有照明用具和电动工具必须防爆。如需明火作业，必须符合公安部门的要求，同时要有应急措施。

④有条件时，应当配备有毒有害气体及可燃气体监测器，以保证人身绝对安全。上述有关沼气池的运行管理及检修、安全制度等规定，还需要在实际工作中不断总结、完善。

第三节

工程主要装置的运行管理、维护保养和安全操作

一、沉砂池1.运行管理

①除砂设备应连续运行

②排除的沉砂不得露天存放，应及时外运，并采取卫生处置措施。

2.维护管理

①寒冷地区应采取防冻措施。②沉砂池每月应清池检修一次。

3.安全操作

在工作台上捞浮渣应注意防滑。

二、固液分离机（立式分离机）1.运行管理

①仔细阅读设备安装、使用说明书，按设备使用说明书进行调整、操作、保养。②固液分离机带负荷运行前，应空载试车。③固液分离机在正常工作时应经常检查设备运转情况，根据废水水质、分离后废水水量及时调节进入固液分离机的废水流量。

④应根据固液分离机分离出的固形物的含水率，按工艺要求调节设备运行参数。⑤每日工作完毕，应对固液分离机彻底清洗，长期不使用应将废水和废渣彻底清理干净，预防结冻。

2.维护保养

①按固液分离机使用说明书的要求定期保养，添加润滑油（脂）。②固液分离机发生故障或损坏时，应及时维修或更换部件。

③当发生过负荷跳闸时，应查找原因，排除故障后方可重新合闸。

3.安全操作

①固液分离机运行时，操作人员不得靠近设备旋转部位。

②固液分离机运行时，操作人员不得站在出料口的正前方以防料液喷出。③固液分离机运行时出现异常现象应立即停机维修。④检修工作必须在停机状态下进行。

三、厌氧消化器（包括i级cstr和ii级uasb）1.运行管理

①厌氧消化器的启动应符合下列规定：

a.厌氧消化器内底部残存杂物应完全清除。

b.厌氧消化器在正式运行前应进行试车、试水和气密性试验，当有渗漏或漏气时应进行修复。复试合格后方可投入运行。

c.对监视厌氧消化器安全运行的有关各类仪表应进行校正。

d.厌氧消化器启动必须采用其他厌氧消化器的厌氧污泥进行接种，接种物料不足时可采用逐步培养法或一次培养法进行扩大培养。

e.当接种污泥运输不便时，可将接种污泥脱水后包装运输。

f.无论是在启动或是在正常运行时均要保证厌氧消化器内料液ph值维持在6.8~7.6之间。

②厌氧消化器投加废液应按具体工艺要求的数量和时间间隔进行。

③厌氧消化器应维持稳定的高温或中温（52℃或者35℃左右）的消化温度。④厌氧消化器的搅拌可连续进行也可间歇进行。一般采用喷射泵搅拌或脉冲进料来完成，在启动期间或产气不足时，应辅以循环泵搅拌。

⑤厌氧消化器内料液的ph值、挥发酸、总碱度和温度及内部沼气压力、产气量和沼气成分宜每日检测，并根据检测数据及时调整厌氧消化器运行工艺或采取相应措施。

⑥厌氧消化器的污泥应按设计要求定时排出。待排泥管排出物稀时应及时关闭阀门。

⑦厌氧消化器溢流管必须保持畅通并应保证厌氧消化器的水封高度，冬季应每月检查。环境温度低于0℃时，应防止水封结冰。⑧厌氧消化器放空清理时应符合下列规定：

a.放空清理时，应停止进料，关闭厌氧消化器与贮气柜的管道，打开厌氧消化器顶部检修人孔；

b.工作人员进入厌氧消化器清理时，必须按有关规定进行操作；

c.当厌氧消化器需长时间停用时，应保持罐内水位不低于罐体高度的1/2，并定期检查及时补充。

2.维护保养①厌氧消化器本体、各种管道及阀门应每年进行一次检查和维修。②厌氧消化器的加热设施应经常除垢、清理。

③当采用螺旋桨搅拌时，轴承应定期检查，添加润滑油，支撑架的连接螺栓应经常检查和紧固。

④蒸汽管道、沼气管道的冷凝水应按设计规定定期排放。⑤厌氧消化器，宜5年彻底清理、检修一次。

3.安全操作

①厌氧消化器的安全防护和操作要求应符合上述有关规定。

②厌氧消化器运行前应将所有试压盲板取出，确保沼气、液体管路畅通。③应定期检查厌氧消化器和沼气管道是否渗漏，保证安全。

④厌氧消化器放空清理和维修时，首先关闭通往沼气贮气柜的阀门、停止进料、打开顶部的人孔，此时方可排料清池，待液面降至下部检修人孔以下，再打开下部检修人孔。

⑤进入厌氧消化器内维修必须采取安全措施，并应有其他人员在池外协作与监护。照明灯必须采用安全电压防爆型灯具。

⑥厌氧消化器排泥时，必须保证厌氧消化器与贮气柜的可靠连通。⑦厌氧消化器的u形防超压管道，应定时检查，保持管路畅通。

⑧操作人员在厌氧消化器上巡回检查，上、下梯时注意防止滑倒及高空坠落造成人员伤害。

第三节沼气贮气柜

一、运行管理

①沼气贮气柜的贮气量和沼气压力，应每班按时观测并做好记录。②沼气贮气柜的压力宜保持在350~400mmh2o。

③沼气贮气柜的水封应保持在设计的水位高度，应适时地补充清水；冬季当气温低于0℃时应采取防冻措施。

④严禁在沼气贮气柜降至低位时排水。

二、维护保养

①应定期检查沼气贮气柜、沼气管道及阀门是否漏气。②沼气贮气柜外表的油漆或涂料应定期重新涂饰。

③沼气贮气柜的升降设施，进出气阀门应经常检查，添加润滑油（脂）。④寒冷地区冬季前应检修沼气贮气柜水封的防冻设施。

⑤沼气贮气柜水封池内存水ph应定期测定，当ph小于6时应换水。⑥沼气贮气柜运行3~5年应彻底维修一次并重新涂钟罩防护油漆。

三、安全操作

①沼气贮气柜的安全防护和操作应符合本规程上述有关规定。

②工作人员上、下沼气贮气柜巡视、操作或维修时，必须穿防静电的工作服，并不得穿带铁钉的鞋或高跟鞋。

③抢修沼气贮气柜应制定安全技术方案，由专业施工队伍进行施工。④严禁将沼气贮气柜水封池中的水随意外排。

⑤冬季要注意水封池及排水阀门的防冻，防止发生负压的正压事故。⑥沼气贮气柜的进、出气管应安装阻火器或水封罐，并定期拆卸清洗。⑦沼气贮气柜的避雷针应在雷雨季节前进行检测、保养。第四节

沼气发电机

一、运行管理①操作人员应熟悉沼气发电机使用说明书中的有关规定。保证发电的质量如电压、频率。按其操作程序启动沼气发电机。②操作人员应经常检查沼气发电机进气管路，防止沼气泄露及冷凝水过多而影响供气。

③沼气发电机工作时应经常巡视、检查沼气发电机的运行情况，发现问题应及时调整或上报有关领导。④沼气发电机在运行中，操作人员应随时掌握负载变化情况并应对沼气发电机的最大负荷进行限制。

⑤沼气发电机的过滤装置应定期清洗。

⑥沼气发电机沼气进气压力不得低于1800pa。

⑦每班记录发电机运行时数、消耗沼气量、输出电功率（电度表数）。

二、维护保养

①按沼气发电机使用说明书的要求进行保养。

②沼气发电机房内的电器设备应每年进行调整和检测一次。③沼气发电机系统必须每周检查一次。

④发动机及调速器必须使用规定型号的润滑油。

⑤发电机余热利用系统的管道、热交换器和保温设施应定期进行检修。

三、安全操作

①专人负责，严禁非操作人员操作。严禁带负荷启动沼气发电机。②当调速装置与发动机断开时，严禁启动发动机。

③沼气发动机发电质量只有满足供电要求（电压、频率）才允许向外供电。④沼气发电机在运行中，遇有紧急情况可采取紧急停车保护。

⑤在发电、供电等各项操作中，必须执行工厂有关电器设备操作制度，不允许并网。

⑥备用沼气发电机和待修沼气发电机应将冷却循环水进、出阀门关闭，放空主机和附属设备内的存水。在冬季当沼气发电机运行结束后必须将主机和附属设备内的存水放空，确保沼气发电机安全运转。

⑦注意室内可燃气体报警器的工作状态，定期运转排风扇，确保沼气发电机安全运转。

⑧发电机系统的冷却水必须使用合格的软化水或在循环水中加入阻垢剂。必要时更换冷却循环水。第五节

污泥脱水设施

（1）采用人工滤层干化场进行污泥脱水时，应符合下列规定

①污泥应按干化场分区依次排入，并均匀铺于干化场上，污泥厚度宜为200~300mm；

②根据污泥排放周期或脱水后的污泥含水率达到标准后及时起运干污泥。最终污泥含水率宜为60%~70%；

③含水率达到要求的污泥应及时起运，避免泥饼过于干燥。（2）采用机械设备进行污泥脱水时，应符合下列规定

①机械脱水前的预处理宜采用加絮凝剂。絮凝剂的选用应根据污泥的性质、运行成本、脱水机的类型等因素综合考虑确定；

②絮凝剂的投加量和配置，应根据污泥性质、污泥消化程度、含水率等因素和脱水工艺情况，通过多次实验确定；

③污泥脱水机带负荷运行前，应经空载试机和调整；④污泥脱水机正常运转过程中，应根据污泥性质及运行情况及时调整投药量、压力、转速等；

⑤污泥脱水结束后，应彻底清洗滤布（网），清理机组周围的污泥，冲洗投药泵、管道及溶药池等。

第三篇：2菌种的选育第一章菌种选育

第一节工业常用微生物及要求

一、常见微生物

（一）细菌（bacteria）

发酵工业中常用的细菌主要是杆菌，主要有：醋杆菌属（acetobacter）乳杆菌属（lactobacillus）

杆菌属（bacillus）。α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）

短杆菌属（brevibacterium）：谷氨酸棒杆菌属（corynebacterium）：谷氨酸

（二）放线菌（actinomyces）

属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。

链霉菌（streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素小单孢菌属（micromonospora）：庆大霉素

（三）霉菌（mould）

亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。）1.曲霉属（aspergillus）

黑曲霉（a.niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸

米曲霉（a.oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲

黄曲霉（a.flavus）产黄曲霉毒素

米曲霉和黄曲霉均为半知菌。

2.青霉属（penicillum）：例如桔子上的绿色斑点

桔青霉（p.citrinum）。产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。

3.根霉属（rhizopus）接合菌

米根霉（r.oryzae）华根霉（r.chinensis）

酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。

4.红曲霉属（monascus）

淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。

（四）酵母（yeast）

单细胞真核微生物，低等真菌。①酵母属（saccharomyces）

啤酒酵母（saccharomycescerevisiae）

②假丝酵母属（candida）

产朊假丝酵母（candidautilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。

③毕赤酵母属（pichia）

产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。

（五）其它微生物

1.担子菌（basidiomycetes）

即菇类（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。

2.藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健食品和饲料。从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的28倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20～35倍。

（六）噬菌体（phage）凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是：①体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。②没有细胞结构，由核酸的蛋白质构成。

③营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。

烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。

噬菌体危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。

二、微生物工业对菌种的要求

1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。

2.易控制培养条件，发酵周期较短。

3.抗杂菌和噬菌体的能力强。

4.菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。

第二节工业微生物菌种的选育

在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。但发酵工业需要培养微生物使其积累大量的代谢产物。所以要采取种种措施打破菌的正常代谢，积累所需要的代谢产物。如青霉素的原始菌种产黄色素，经菌种选育，可使产生菌不再分泌黄色素。土霉素产生菌产生大量泡沫，经诱变处理改变遗传特性可使泡沫减少，节省大量消泡剂。菌种经诱变获得抗phage的特性。

菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。

一、自然选育：从自然界分离获得菌种，根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种

㈠从自然界分离获得菌种1.采样。取地面5～15cm的土壤。

2.增殖培养。（富集培养enrichment）提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。

方法：

（1）控制培养基的营养成分。如淀粉琼脂培养基用于丝状真菌增殖。

（2）控制培养条件：

细菌，放线菌：ph7.0～7.535～37℃霉菌，酵母菌：ph4.5～6.020～28℃

（3）抑制不需要的菌类

分离细菌：加入丙酸钠以抑制霉菌，酵母分离厌氧菌：焦性没食子酸与氢氧化钠反应除氧

3.纯种分离

（1）划线法：简单、快速。（2）稀释法：在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的几率大，适合分离具有蔓延性的微生物。固体培养基四区划法接种法步骤一

接种针先以火焰灭菌法灭菌步骤二

轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却步骤三

以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。步骤四

更换一个新的无菌营养平板步骤五

将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。步骤六

重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤七

由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。步骤八

重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。步骤九

重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。步骤十

在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。

固体培养基的稀释涂抹接种法

【目的】

用来分离单一菌落或用来估计样本中微生物的数目。需要使用的仪器——震荡机吸取准备好欲稀释的菌液吸取充分均匀后的菌液

取含有9ml无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。

将试管于震荡机上，使菌液混合均匀

取出试管中的第一次十倍稀释菌液1ml，加入另一个新的含9ml无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。

从最后稀释菌液中吸取0.1ml菌液，置入准备好的无菌琼脂内。将三角玻璃棒浸于酒精中

将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）

使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。

4.生产性能的测定：纯种分离后得到菌株数量大，不可能一一进行性能测试。一般采用两步法：初筛，复筛。从而获得较好菌株（野生型菌株）（区别于变异菌株）。

初筛：以量为主

复筛：以质为主

㈡从自发突变体中获得菌株

微生物可遗传的特性发生变化称变异，又称突变，是微生物产生变种的根源，也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。但自发突变的频率较低，往往不能符合工业生产的要求。因此要利用诱变剂提高菌种的突变频率。

二、诱变育种

用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。是当前菌种选育的一种主要方法。因为人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，速度快，方法简便。但诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合。所以诱变育种的主要环节是：（1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液——诱变

（2）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株——筛选

诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂：物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍

1.诱变育种的程序

选择出发菌株（parentstrain）→制备菌悬液→前培养（添加嘌呤，嘧啶或酵母膏提高变异率）→诱变（物理诱变，化学诱变）→变异菌株的分离和筛选2.突变株的筛选：

摇瓶筛选法：挑单菌落接斜面→接摇瓶→测生产能力琼脂块筛选法：打孔器取出培养，置鉴定平板测发酵产量。

①随机筛选。传统方法，但要耗费大量的人力物力。近年来，随着遗传学，生物化学知识的积累，人们对于代谢途径，代谢调控机制了解得更多，所以筛选方法逐渐转向理化性筛选。

②理化性筛选。介绍初级代谢产物高产菌株的筛选。根据代谢调控机理，氨基酸、核苷酸合成途径中普遍存在反馈阻遏和反馈抑制。这对于生产菌本身是有意义的，可以避免合成过多的代谢物而造成的浪费。但在工业中，需要生产菌产生大量的氨基酸，核苷酸等产物。所以要打破微生物原有的反馈调节系统。

方法㈠降低终产物浓度

a.筛选终产物营养缺陷型

获得缺少第三个酶的突变株，需供给e才生长。限量供给e，可打破反馈调节，产生大量c。

b.筛选细胞膜透性改变的突变株

使终产物排出细胞，以降低细胞内终产物浓度，避免终产物反馈调节。如：用谷氨酸棒杆菌（corynebacteriumglutamicum）的生物素营养缺陷型（biotindeficiency）进行谷氨酸发酵。

生物素：是b族维生素的一种。又称维生素h或辅酶r。生物素是合成脂肪酸所必需的。因为脂肪酸的生物合成是：

利用糖代谢中间产物乙酰coa（直接原料是丙二酸单酰coa）在乙酰coa羧化酶（多酶复合体，辅基为生物素）催化下合成。脂肪酸＋甘油磷酸

╰╯磷脂＋蛋白质

╰╯

生物膜

因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。

该缺陷型在生物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因而使细胞膜的渗透性发生变化，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外的发酵液中。

如果使用油酸缺陷型菌株或甘油缺陷型菌株，即使在生物素过量的条件下，也可使谷氨酸在体外大量积累。

㈡筛选抗反馈突变菌株

a.筛选结构类似物抗性突变株

用代谢产物的结构类似物处理微生物细胞，可抑制或阻遏自身的合成酶类。因此细胞由于缺少这种氨基酸不能生长或者死亡。而那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍可生长，从而可以筛选出该代谢物的抗反馈突变株。b.利用回复突变筛选抗反馈突变菌株

出发菌株经诱变处理，获得对产物敏感的营养缺陷型。再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到恢复突变株。筛选的目的不是要获得完全恢复原有状态的回复突变株，而是希望经过两次诱发突变所得的回复突变株不受产物的反馈抑制。如：谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。

第三节生产菌种的改良

上述诱变育种可以获得高产菌株，缺点是工作量大，且带有相当的盲目性，不能达到定向育种的目的。

随着现代生物技术的发展，原生质体融合，dna重组可以达到改良菌种的目的。

一、原生质体融合（protoplastfusion）

原生质体。脱去细胞壁，只有细胞膜包裹的球状体。

1.标记菌株的筛选：要求两个亲株性能稳定，并带有遗传标记（营养缺陷型和抗药性）

2.原生质体的制备：用适当的溶壁酶除去细胞壁，得到两种不同的原生质体3.原生质体的融合与再生：两个亲株的原生质体在高渗条件混合，在助融剂（融合剂）作用下融合，这是原生质体融合的先决条件。然后是细胞壁再生，即恢复完整细胞并能生长分裂（必要条件）。聚乙二醇（peg）－脱水剂

助融剂

ca2+－提高融合频率

4.融合子的选择：融合后产生两种情况：真正的融合——产生杂合二倍体或单倍重组体暂时的融合——形成异核体

所以要获得真正融合子，必须在融合子再生后，进行几代自然分离选择，才能确定。

该方法仍属于一种半理化性筛选，因为尽管采用的两亲株的特性是已知的，但它们基因组的交换和重组是非定向的。

二、dna重组技术（dnarecombinationtechnology）

又称基因工程，遗传工程。是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门技术。是按人的意志，将某一生物（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组dna分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源dna片段在后者内部得以表达和遗传。

1.目标dna片断的获得2.与载体dna分子的连接3.重组dna分子引入宿主细胞

4.从中选出所需重组dna分子的宿主细胞

作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑。

第四节菌种的衰退、复壮与保藏

一、菌种的衰退

衰退的原因：

1.菌种保藏不当

2.菌种生长条件没有得到满足

二、菌种的复壮1.纯种分离

2.通过寄主体进行复壮3.淘汰已衰退的个体

三、菌种保藏

1.原理人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。

低温、干燥、缺氧、缺营养物质2.方法

（1）斜面保藏法：用螺旋口试管防失水，尽量减少碳源含量

（2）干燥保藏法：沙土管，固体曲

（3）悬液保藏法：将微生物悬浮在不含养分的溶液中（水、生理盐水、buffer）（4）冷冻干燥保藏法：冷冻，减压蒸发除去水分，使生命活动停止

（5）低温保藏法。大多数微生物可在-20℃以下的低温中保藏，比冷冻干燥更为常用。

（6）液氮保藏法

第五节种子的扩大培养

一、微生物的培养方法

1.表面培养。是一种好氧静置培养法。如固体斜面，固体平板，液体培养表面形成的膜状物。

2.固体培养：工业上常用大米，麸皮，米糠，谷壳等，再加一些其它营养成分灭菌后制成。特点：疏松，培养基内部充满了空气。既可静置培养，又可通风培养，是介于表面培养和深层培养之间的一种培养方式。

3.液体深层培养。又叫液体通风培养。

菌体在液体培养基中处于悬浮状态，导入培养基中的空气通过气液界面传质进入液相，再扩散进入细胞内部。在专门的发酵罐中进行。

二、菌种的扩大培养p252由于工业生产规模的增大，每次发酵所需的种子（纯种培养物）就增多，要使小小的微生物在几十小时内完成如此巨大的发酵转化任务，必须具备数量巨大的微生物细胞才行。

菌种扩大培养的目的：

为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。

（一）种子制备的工艺流程

摇瓶

保藏菌种→试管斜面活化→茄瓶斜面→种子罐

固体培养基

（一级种子）（二级种子）→摇瓶→种子培养→发酵培养

（二）斜面菌种的培养p2471.不宜多次移种。一般只移接三次，防自然变异。

2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。

培养基特点。原料较精细。

（三）一级种子培养（摇瓶）

用三角瓶进行，液体恒温振荡，即摇瓶。

有些发酵产品（如谷氨酸），一级种子培养不用摇瓶，而是用大型斜面（茄瓶），优点是可一次制备一批大型斜面，置于冰箱中，比液体斜面培养物易于保存，不必每天制备液体一级种子。

培养基特点。使用的原料基本接近于发酵培养基。

（四）二级种子培养（种子罐）

种子罐大小根据发酵罐大小和接种量确定。培养基组成与发酵罐培养基基本一致，但所含的配比量可有差异。

培养基的特点。和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，更接近于发酵培养基。

大量地接入培养成熟菌种的优点：

1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率。

2.节约了发酵培养的动力消耗。

3.并有利于减少染菌机会。

（五）种子罐级数。制备种子需逐级扩大培养的次数。

①对于生长快的细菌（如谷氨酸），种子罐→发酵罐——二级培养（一级种子罐扩大培养）②对于生长较慢的菌种（如青霉素生产菌），利用：种子罐→种子罐→发酵罐——三级培养（二级种子罐扩大培养）

（六）接种龄与接种量p253①种龄。种子培养时间称种龄。

生产中，一般选在生命力极为旺盛的对数生长期。种龄过于年轻：前期生长缓慢，发酵周期延长种龄过于年老：导致生产能力衰退最适种龄通过实验确定。②接种量

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。发酵罐的接种量大小与菌种特性，种子质量和发酵条件等有关。一般细菌接种量在1%左右，霉菌接种量在10%左右（7%-15%）接种量过大：菌种生长快，培养基过稠，溶氧不足。接种量过小：发酵前期菌体生长缓慢，发酵周期延长。

近年来，谷氨酸生产中，以大接种量和丰富培养基作为高产措施。如：高生物素，大接种量，添加青霉素的工艺。

为了加大接种量，有些品种的生产利用双种法，即两个种子罐的种子接入一个发酵罐。

第四篇：微生物菌种、毒株的管理规定2013版微生物菌种、毒株的管理规定

为加强可感染人类的高致病性病原微生物菌种、毒株的管理，保障人体健康和公共卫生安全特制定本规定。

一、菌种、毒株的保藏和管理严格按《中华人民共和国传染病防治法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《可感染人类的高致病性病原微生物菌种、毒株管理规定》等法律、行政法规的规定执行。

二、设立《微生物实验室菌种登记表》，其内容包括。菌种编号、菌种名称、菌种来源、保存日期、数量、保存条件、存放位置、保管人。

三、严格的登记制度、建立详细的总账及分类账。

四、根据菌种的特性选择适宜的保存方式。采用双人管理。

五、根据菌种情况，定期检测菌种品质，发现菌种变异或退化时应及时报告，并查明原因。

六、菌种的发放需要双保管人员同时在场的情况下才能进行。每次使用标准菌株都应做好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。

七、购买的标准菌株初次复苏使用时，应批量保存在菌种管中，-20℃以下保存。

八、新的标准菌株复苏后，传代最多不超过3次，如超过3次将不再作为标准菌株使用。

九、标准菌株保存管一经解冻使用后，不得再次冻存。

十、菌种必须装在密封的专用容器内高压灭菌销毁，并做好销毁记录。十

一、菌种、毒株失窃要及时报告处理，并有相应的应急预案。

微生物实验室菌种、毒株管理者：

20

第五篇：菌种的分离与筛选一、微生物工业对菌种的要求

（一）、微生物工业的生产水平由三个要素决定。生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。

（二）、微生物工业对菌种的要求是：

（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;（4）能够高效地将原理转化为产品;（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性，

二、工业用微生物菌种的来源及选育

（一）微生物菌种的来源

一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：

（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；

（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。

当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。

（二）微生物工业菌种的分离

1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤

菌种分离的流程如下：

标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏

①采样

采样季节。以温度适中，雨量不多的秋初为好。

采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。②标