胞质内单精注射技术的研究进展

胞质内单精注射技术的研究进展

单精细胞成像（icsi）是指用显微手术技术将单精插入卵细胞浆中的过程。ICSI是一种新型的体外受精技术,对于细胞和分子机制研究很有意义,其可以调控注射入卵的成分及量以观察对受精的效应;确定授精时刻以观察精卵融合时间及受精后续事件发生时间;可固定精子进入位点,控制原核极性和胚胎质量,利于研究受精后精核的解聚和原核的发育能力(陈秋菊等,2003),对揭示哺乳动物雌雄配子间相互作用机理和受精本质具有重要理论意义,对提高良种公畜的利用率和保护濒危动物资源及拯救珍稀动物具有潜在的实践意义(杨增明等,2005)。目前,ICSI已被应用于人类的辅助生殖(Van等,2005)、突变系小鼠的种质资源保存(Ming等,2005)及转基因动物生产(Ogura等,2005,2003)等方面。在传统的体外受精(invitrofertilization,IVF)过程中,哺乳动物的精子与卵细胞作用发生在3个不同水平:①卵丘颗粒细胞和透明质酸细胞外基质(放射冠);②卵透明带(zonapellucida,ZP);③卵子质膜(张军等,2005)。ICSI的受精机制有别于IVF,它避开了IVF过程中这3大屏障的筛选作用,其以单精受精率高、多精受精率低及不受精子浓度、形态、活力的影响等优点,在全世界得到广泛应用并受到高度关注。理论上讲ICSI的受精率应该为100%,但研究结果发现其受精率仅为70%左右(Mahutte等,2003),因此有必要了解ICSI技术的影响因素,以期进一步提高ICSI的成功率。1精子因子假说ICSI对精子几乎没有限制,活精子、死精子、射出的不运动的精子、附睾精子和睾丸精子都可用于ICSI,并可获得很高的受精率(杨增明等,2005)。精子头是受精最重要的部分,单独精子头注射可以使卵细胞活化;精子尾注射却不能;注射精子核也可活化卵细胞,但活化率较低(陈秋菊等,2003)。人们据此提出了精子因子假说,该假说认为:精子胞质中存在某种或几种可溶性信号分子,在精卵质膜融合或稍后,该信号分子通过融合进入卵子胞质中,从而激活卵子内钙释放系统而使卵子活化。即精子内存在卵细胞活化因子(sperm-bornoocyte-activatingfactor,SOAF)。另外,ICSI过程中没有细胞膜的融合,故精子制动很必要,其能破坏精子细胞膜,使精子细胞膜肿胀,卵细胞中的精核去浓缩因子进入精细胞,使精细胞释放SOAF,激活卵细胞(张轶乐等,2005)。而且在制动过程中,精子质膜受到损伤,能够提高受精率,这是由于质膜完整的活动精子注入卵子后,精子在胞质内运动一段时间,会对卵子的细胞器和细胞骨架造成损伤。2卵母细胞及其质量卵母细胞成熟后才具有受精能力,卵的成熟包括胞核及胞质的成熟。排出第一极体仅是卵母细胞核成熟的标志,极体的不同形态反映核成熟度的不同。通常超数排卵能使大量的卵母细胞快速达到MⅡ期,但同时促进了第一极体的退化,造成MⅡ期卵的第一极体呈现不同形态,这种卵母细胞异常受精率较大,其正常受精卵也会产生低质量的胚胎,而且它的纺锤体容易受损,染色体易丢失;第一极体形态异常也会导致非整倍体增加,影响胚胎发育,此种卵细胞不应该用于辅助生殖技术(彭弋峰等,2004)。卵母细胞胞浆充分成熟有2个重要标志:①皮质颗粒(CGs)向浆膜下迁移并沿质膜呈线性排列;②成群线粒体(mt)散开。这是由于前者为精子进入胞浆后迅速发生的皮质反应和透明带反应创造了良好的条件,后者有利于卵母细胞充分成熟过程中能量的利用。另外,卵母细胞的质量均以受精率、卵裂率及良好胚胎形成率等方面来评定。朱亮等(2005)试验结果显示,观测有纺锤体的卵母细胞的正常受精率和良好胚胎形成率,均明显高于无纺锤体的卵母细胞,但是正常受精的卵母细胞卵裂率,并不因为其是否有纺锤体而有所不同。3小鼠精子激活试验受精激活主要包括2个概念:①卵母细胞的激活,可由精子完成,也可由物理化学刺激完成;②精子激活,精子进入成熟卵母细胞后,在细胞质中某些因子的作用下,才能完成核去致密和组蛋白替代鱼精蛋白的过程(陈秋菊等,2003)。卵母细胞的激活是以启动并完成第2次减数分裂、放出第二极体、皮质反应、雌原核的形成和卵子代谢启动为标志;精子激活则以精核去致密、雄原核形成和发生DNA合成等为标志(陈大元,2000)。Rawe等(2000)试验指出:由于卵母细胞激活失败导致受精失败,在ICSI中占39%,而在IVF中仅占15.1%,表明卵母细胞激活不足是导致ICSI受精失败的主要原因。由于ICSI越过了自然受精时精子需要经过许多的环节,如顶体反应、精子与透明带结合、精卵质膜融合等,所以往往不能使卵母细胞完全激活。因此,ICSI时必须通过显微注射针的机械刺激及注入精子的生物刺激来激活卵母细胞。在保证卵膜穿破的同时,注射精子前尽量轻柔的重复多次抽吸胞浆,充分引发Ca2+释放以及Ca2+附加峰,达到激活卵母细胞的目的。也可通过多种人工处理,如电脉冲激活、与钙离子载体A23187共孵育等方法,促使卵子激活。舒益民等(2003)将ICSI中41个受精失败的人卵母细胞,在5μmol/L的Ca2+载体A23187中处理5min,观察第二极体排出及原核形成情况,发现有30个发生激活,其中24个表现为2PB+2PN,占被激活卵母细胞总数的80%,激活后继续培养54h,19个发生分裂,9个发育到2～4细胞,5个发育到4～8细胞阶段,5个发育到8细胞以上阶段,表明Ca2+载体A23187能够有效激活ICSI后受精失败的卵母细胞恢复受精并继续发育成胚胎。4操作技术4.1微注射针尖的尺寸、操作条件及操作设备微注射针尖的内径及斜面的角度,对显微注射时卵细胞损伤程度的大小起着至关重要的作用。杨益寿等(1998)试验结果表明,小鼠的ICSI针尖内径在4～5μm、斜面在35°～40°较为合适,此时,整个精子头部正位于管口,进针容易,且带入操作液较少,对卵细胞机械损伤小,可获得较高的受精率。因为当微注射针尖的内径大于6μm,会造成卵细胞较大的损伤,使卵胞质较多外流,并使随精子进入细胞质的操作液过多,导致卵细胞溶解。内径小于4μm时,整个精子头部完全卡在注射针口外,进针时易使精子头和尾分离,不能进入卵细胞质内,给操作带来一定困难。而且由于小鼠卵细胞透明带及卵膜有一定的韧性,斜面大于40°,进针时会遇到较大的抵抗,难以一次穿透透明带及卵膜,破坏了细胞质的稳定状态,使受精后的卵细胞不能正常发育。对山羊的ICSI,注射针管的内径以6～8μm为宜(赵晓娥等,2005);在水牛有使用内径8μm(孟凡丽等,2004)针管的报道。另外,根据操作设备的不同,微注射针尖的斜面角度有所不同。如果使用Piezo操作系统,拉制过的针在适当口径处断开后,无需磨针和拔尖即可使用。4.2精子注入的位置和时间因为MⅡ期的纺锤体位于卵胞浆外周,与第一极体紧邻,为了避免损伤卵母细胞纺锤体,影响受精和胚胎进一步发育,所以第一极体与精子注入的相对位置在ICSI过程中是一项重要的技术参数。传统的ICSI操作是转动卵母细胞,使第一极体位于6点或12点的位置,然后在3点的位置注入精子。此操作是建立在成熟卵母细胞纺锤体靠近第一极体假设的基础上的,注入精子位置的选择是为了避免损伤卵母细胞纺锤体。Garello等(1999)认为卵细胞刚完成第一次减数分裂逸出第一极体后停滞在MⅡ期,此时第一极体可能和纺锤体相毗邻,但随时间的推移第一极体便在卵周隙内移动。Hardarson等(2000)研究结果发现,第一极体与纺锤体所成的夹角在(26.6±3.3)°～(41.7±4.0)°,约93%卵的纺锤体和第一极体位于卵细胞的同一半球,所以不能根据第一极体来准确预测纺锤体的位置。彭弋峰等(2004)认为在进行ICSI时,应尽可能使第一极体远离固定针、注射针和精子,将极体置于11点和与之对称的7点,使纺锤体离精子最远,可最大限度地减少卵细胞内部组织结构被破坏。4.3膜穿破方式的影响的关键是能够成功地穿破卵膜,将被制动的单个精子置于卵母细胞胞浆内。卵膜的穿破形式取决于操作技术环节和卵母细胞自身的特性,如卵膜的弹性以及卵母细胞本身的质量都会影响卵膜的穿破形式。罗海宁等(2002)比较了人卵母细胞膜穿破方式为显微注射针直接进入胞浆内、卵膜穿破、不形成凹痕(A)及显微注射针进入卵母细胞内、回吸少量胞浆、卵膜在细胞中部穿破、形成轻微的凹痕(B)2种类型时的卵母细胞存活率、卵母细胞受精率和卵裂胚胎的发育质量,结果表明卵母细胞膜穿破方式为A类型时的卵母细胞存活率、卵母细胞受精率、卵裂胚胎发育质量均显著低于B类型组。这可能是由于A组膜穿破方式的卵母细胞膜弹性不足,脆性偏高,使得注射针的冲击力对卵母细胞显微结构的破坏性加强,故而A组细胞存活率低,易退化;而B组卵母细胞膜穿破方式中形成的凹痕可防止卵母细胞退化,因为弹性凹痕的形成缓冲了胞浆回吸造成的压力,有助于胞膜完整性的恢复,减少了胞浆和部分细胞器的破坏和丢失。另外,卵母细胞膜穿破方式的差异也可能是由膜本身脂蛋白结构上的糖基支链等的不同所决定的。4.4精子操作液对icsi胚发育的影响聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)经自由基聚合而成的一种十分重要的水溶性高分子聚合物,具有良好的溶解性、化学稳定性、成膜性、生理惰性和粘接能力。PVP作为精子操作液中的一种成分,一方面使液体变得粘稠,减缓精子运动速度,易于将精子吸入和排出,方便ICSI操作;另一方面可以防止膜损伤后的精子粘在管壁上。但是由于PVP本身具有化学物质的一些活性,当随着精子一起注入卵母细胞质后可能会对胚胎发育造成影响,因此要选择合适的PVP浓度。许多研究者以前均广泛采用10%的PVP浓度,后来发现适当降低这一浓度不会给操作带来困难。赵晓娥等(2005)研究结果发现当精子操作液中PVP浓度从10%降低到8%和5%时,ICSI胚的卵裂率差异不显著,但正常卵裂率、桑椹胚率、囊胚率有所提高,5%和10%的正常卵裂率(69.6%和58.5%)、桑椹胚率(45.6%和35.2%)、囊胚率(26.9%和16.9%)差异显著(P<0.05)。结果表明,含5%PV