焦化厂排水底泥上多环芳烃降解菌的筛选

焦化厂排水底泥上多环芳烃降解菌的筛选

多环芳烃（pahs）是环境中的一般有机污染物，也是迄今为止发现和研究的第一个化学污染物。多环芳烃在环境中污染面广而分散,不易集中治理,一些环境微生物经过适应性驯化和诱导,可以对PAHs进行代谢分解,甚至矿化。已有研究表明,微生物修复(降解)是环境中多环芳烃去除的最主要途径。多环芳烃降解菌的筛选一直是国内外生物降解的一个重要方面。迄今已分离到多种降解菌,但多以降解萘、菲等低分子量PAHs为主。近年来,进一步筛选四环或四环以上的高分子量PAHs高效降解菌成为多环芳烃修复工作的必然趋势。而芘作为高分子量PAHs的典型代表,常被作为监测PAHs污染的指示物和其他PAHs光化学降解、生物降解的模型分子。因此本实验以焦化废水排水沟底泥为优良菌源,通过驯化分离筛选出多环芳烃优势降解菌并对其对芘的降解性能进行了初步研究,以期为实际微生物修复多环芳烃污染环境奠定基础。1材料和方法1.1抗菌、辩证物的制备菌源:焦化废水毒性大,含多种多环芳烃及杂环芳烃,本研究以陕西富平焦化厂焦化废水排水沟底泥为优良菌源,其外观为半流体,呈黑褐色。驯化实验用土壤:西安建筑科技大学小西门内东侧花园土。晾干,粗筛(除去树枝,碎玻璃等杂物),过1mm×1mm筛,备用。1.2培养基的制备5.0g/L芘丙酮标准溶液:准确称量0.2500g芘标准试剂,用丙酮溶解于50mL棕色容量瓶中并定容,摇匀使芘浓度为5.0g/L。牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸馏水1000mL,pH7.2~7.4。121℃高压蒸汽灭菌30min备用。无机盐培养基:磷酸盐缓冲液:K2HPO4·H2O21.75g,Na2HPO4·12H2O33.4g,KH2PO448.7g,NH4Cl5.0g,蒸馏水1000mL;MgSO4溶液:MgSO422.5g,蒸馏水1000mL;FeCl3溶液:FeCl30.25g,蒸馏水1000mL;微量元素溶液:MnSO439.9mg,ZnSO4·H2O42.8mg,(NH4)MoO24·4H2O34.7mg,蒸馏水1000mL。取上述磷酸盐缓冲液5.0mL,MgSO4溶液3.0mL,CaCl2溶液1.0mL,FeCl3溶液1.0mL,微量元素溶液1.0mL,定溶至1000mL。经高压蒸汽灭菌,备用。分离纯化培养基:在无机盐培养基中加入2%的琼脂,湿热灭菌后,在无菌操作下加入多环芳烃碳源混合物,摇匀。然后在灭好菌的培养皿中倒成平板备用或分装于提前灭菌的带塞试管中制成斜面备用。1.3测试方法1.3.1土样的制备取来含优良菌源的污泥后,用均匀处理器处理20min使污泥分散均匀,充分曝气活化24h。称取土壤1kg放入自制土壤反应器中,加入蒽菲芘各25mg、葡萄糖1g、Mn2+5mg后搅匀,再加入活化后的优良菌源,加水搅拌使土壤达一定湿度(目测土壤均匀,松散,潮湿),把反应器放入学校花房温室(使之通风、可接受阳光又免受雨淋),以后每天浇水、搅拌。驯化周期为三个月。称取10g驯化后的新鲜土样于250mL三角瓶中,在无菌操作条件下,加入90mL无菌水,浸泡振摇20min。上清液用无菌水稀释,分别取107、108、109三个倍数的稀释液各0.2mL于盛有分离培养基的平板中央,用玻璃刮刀均匀涂布,37℃恒温培养箱中培养2d,挑取长势较好的单一菌落划线分离,反复划线分离,直至获得纯菌株。根据初步筛选出的优良菌对芘的降解情况进一步优选多环芳烃降解菌。1.3.2菌悬液的制备无菌条件下,从斜面上挑取一环菌,接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中,30℃,150r/min恒温振荡,好氧培养48h,室温下6000r/min离心分离30min,用磷酸盐缓冲液反复冲洗菌体3次,并离心收获菌体,再用该缓冲液将菌体制备成较浓的菌悬液。1.3.3甲苯用量的测定细胞表面疏水性采用BATH测定方法,具体为取一定量调整浓度(OD600=0.530~0.540)的菌悬液4mL于圆底具塞玻璃管中,按梯度加入二甲苯,对照组不加二甲苯。室温下剧烈振荡60s,静置5min分层。用无菌注射针头快速吸取下相水溶液3.0mL,以磷酸盐缓冲液为对照,在600nm波长下测定A值,每个实验重复三次。细菌细胞表面疏水率(CSH%)按下式计算:1.3.4酶清效试验优良菌对芘的降解过程用MPN法测定菌体的生长情况,具体为将水样做倍比稀释,至适宜的稀释度为止,应使低稀释度的各管都长菌,而以高稀释度的各管不长菌为宜。每个稀释度重复接种至少3管。37℃恒温培养箱中培养2d,检查结果确定数量指标,绘制生长曲线。1.3.5初始浓度的确定在150mL锥形瓶中加入适量的无机盐培养基,接着准确加入5.0g/L芘丙酮标准溶液0.2mL,放入30℃,160r/min的恒温摇床振摇45min,使丙酮尽快挥发。随后取下各瓶,加入一定量的菌悬液使种子浓度为109CFU/mL,使反应体系总体积为20m,即芘初始浓度为50mg/L。最后以8层纱布封口,重新放入30℃,160r/min恒温摇床振摇,分别在反应一定时间后,取下用环己烷萃取。1.3.6标准曲线法检测取下反应瓶,把水样用环己烷在125mL梨形分液漏斗中反复萃取三次,萃取上清液合并于10mL比色管定容。然后,取0.2mL在另一比色管中稀释到10mL;在波长为242nm处用紫外分光光度法测其吸光度,根据标准曲线换算成浓度。回归直线方程为:y=2.2982x-0.009,R2=0.9996。芘降解率为:芘降解率=(芘初始加入浓度-芘剩余浓度)/芘初始加入浓度×100%(2)2试验结果与分析2.1优良菌株的筛选2.1.1生长时间及菌落长度的筛选经平板划线分离纯化后,共得到30余株多环芳烃降解菌。在筛选的过程中,根据各菌种在筛选培养基上生长出来的时间及菌落的长势,从30余株中挑选9余株生长时间快菌落典型的菌种保存。根据其在驯化筛选培养基上生长快慢,长势好坏,以及菌落的典型性,综合考虑选取1#,2#,4#,5#,7#,9#,并保留一组天然混合菌做进一步优选实验。2.1.2菌体表面疏水性对反应体系的影响细菌的细胞表面疏水性是决定细菌非特异性黏附到各种生物和非生物表面及界面的最重要的因素之一,也是影响细菌吸收和降解疏水性有机物质的主要因素之一,因此研究细菌的细胞表面疏水性具有一定意义。实验首先测定了利用牛肉膏蛋白胨培养基培养出的细菌的菌体表面疏水性,其结果如图1所示。从图1中可以看出4#菌的疏水性最大为65.5%,2#菌疏水性次之为50.0%,9#菌的最小为10.2%,1#菌、5#菌、7#菌的疏水性居中,在20%~40%范围内。细菌表面物质成分相当复杂,但只有含有疏水侧链或疏水端的成分才决定细菌的表面疏水性。细胞壁和膜中的疏水性脂质物质、亲水性低聚糖、不断重复的糖蛋白使得脂多糖分子具有两亲性特点,菌体表面的憎水性说明细胞与憎水性的物质有较强的相容性。菌体表面性质的不同可能影响到细胞摄取多环芳烃的方式,进而影响到多环芳烃分子的生物降解过程。按照1.3.5节中的试验方法进行试验,试验过程中观察发现,芘反应体系初始有均匀的微小白色片状物漂浮于水面,溶液呈乳白色。随着培养时间的延长,体系内逐渐出现微小白色泡沫和白色絮体,而空白对照几乎无变化。萃取过程中发现降解初期疏水性大的菌株反应液乳化严重,随着降解时间的延长这种乳化程度变弱;降解初期疏水性小的菌反应液在用环己烷萃取时乳化不严重,但是随着降解时间的延长乳化程度增加。菌体表面疏水性是菌体的非特定性表面性质,根据疏水性测定原理可以推测菌体表面疏水性发生了变化。分别在不同时刻取下反应体系萃取测值,实验结果如图2所示。从图2中可以看出随反应时间的延续,各菌对芘均呈现一定的降解能力(空白对照曲线一直很低),且降解率趋势总的来说是不断升高的。在给定反应时间初期2d时,2#菌和4#菌降解率曲线斜率最大,降解最快,此后2#菌降解率稍有回落,之后稳固上升,降解速率最快;4#菌降解率回落后降解率曲线保持平缓。9#菌降解曲线波动很大,在1~2d稳固增加,2~6d曲线稍有回落,接着呈上升趋势,到第10天大幅度回落,但总的趋势也是不断上升的。从第13天的降解率结果看,2#菌降解最快,其次是5#菌和9#菌。有文献报道菌体表面疏水性有可能导致菌体表面对多环芳烃这类疏水性物质的吸附,4#菌疏水性最大,反应初期芘的表观降解率大很可能与菌体表面疏水性大导致芘在菌体表面的吸附结合有关,而不是真正的降解。从图2还可以看出天然混合菌的降解并不快,没有显示出各菌之间的协同优势,说明获得的天然混合菌并一定是降解多环芳烃的优势组合菌。根据1.3.4节的实验方法,处理数据后得到各菌的生长曲线见图3,由图3可以看出各优良菌种在芘做唯一碳源的无机盐培养基中有不同程度的生长,菌种的生长可以粗略地认为都经过延滞期、对数期、平稳期、衰减期四个阶段。由图3中可以看出各菌经历四个阶段所需的时间不同,稳定期均较长。各菌种生长量达到最大值所需的时间分别为1#菌需10d,2#菌需5d,4#菌需3d,5#菌需10d,7#菌12d,9#菌需6d。从菌种在以芘为唯一碳源的体系中生长状况看,菌种能够以芘为碳源生长,并且生长速度并不慢,生长旺盛。这进一步说明它们是好的、能够代谢分解芘的菌种。各菌种在培养基中的生长周期不同,这是由于各菌种本身的差异,对生长环境的适应能力,以及自身的繁殖能力等。从生长曲线结果看10d前,4#菌生长最好,其次是2#菌,10d后开始进入衰减期,5#菌后期生长较快在第10天达到其生长量最大值,超过2#菌和4#菌。其他各菌生长曲线变化平缓。从图2和图3可以看出在初始芘浓度为50mg/L的体系中,2#菌生长的好也降解的快,5#菌在10d时生长旺盛,降解率也有增快的趋势。而4#菌生长良好降解率却不高,这说明并不是所有生长好的菌,降解率都高。生长能力和降解能力没有必然联系。根据实验结果,选取降解效率好,并且具有表面性质有代表性的2#、9#菌为对象做本论文下面的实验。2.2温度对优良菌降解的影响按照1.3.5节中的方法准备一批反应体系,最后分别放入20℃、25℃、30℃、35℃、40℃,160r/min恒温摇床振摇。在48h时取下测定反应体系中剩余芘浓度,计算降解率,以确定温度对优良菌降解芘的影响。试验结果见图4,从图4可以看出,温度对2#菌和9#菌对芘的降解有一定的影响。对于2#菌在30℃时,对芘降解率最高,48h降解率达23.57%,小于或大于这个温度降解率均变低;对于9#菌情况正好相反,30℃时降解率最小,温度增大或变小芘降解率都增加。40℃的降解率相对最高为28.26%。其原因有待进一步研究。2.3无机离子对优良菌降解的影响本节试验研究Mn2+、Zn2+、Co2+、Mo6+、Fe3+、Cu2+各离子对2株优良菌对芘降解的影响,并做不加上述离子的对照试验。其中各离子浓度控制在3mg/L,其他操作参见1.3.5节。在48h时取下测定反应体系中剩余芘浓度,计算降解率,以确定无机离子对优良菌降解芘的影响。试验结果见图5,从图5中可以看出,对于2#菌Mn2+和Mo6+对降解有促进作用,且前者优于后者,降解率可以分别提高4%和2%;Co2+、Fe3+、Cu2+均有不同程度的抑制作用,其中Cu2+最为明显;Zn2+对2#菌的降解没有影响。对于9#菌各离子对降解没有明显的促进作用,其中Mn2+、Co2+、Cu2+对降解影响不显著,而Zn2+和Fe3+均有不同程度的抑制作用,其中Zn2+最为明显。Mn2+对2#的芘降解有促进作用,这可能是由于Mn2+是一些微生物酶的激活剂,可以加快微生物的生化反应。2.4葡萄糖对2#、9#菌的降解率以葡萄糖和脲作为外加碳源,外加碳源浓度为100mg/L。其他操作按照1.3.5节方法进行。反应48h后测定芘剩余浓度,计算降解率。结果如图6所示。从图6中可以看出葡萄糖对2#、9#各菌的降解均有促进作用,其中对2#菌的促进较为明显,48h可以使降解率提高4%。这可能是由于葡萄糖是微生物生长的良好的营养物质,它的存在使菌体生命活动加强,对芘的代谢能力进一步加强。脲对2#菌的降解有抑制作用,对9#菌的降解几乎无影响。其抑制作用很可能是由于脲与芘产生竞争代谢引起的,这一原因有待证实。3不同菌株对的降解特性(1)以焦化厂废水沟底泥为菌源驯化分离筛选出6株菌,保存了一组天然混合菌。研究结果表明,各多环芳烃优势菌的菌体表面疏水性不同,且这种不同可以影响到反应初期菌株对芘的表观降解率,总的来说菌体的疏水性表面较亲水性表面对多环芳烃有更强的吸附性。菌种的表面疏水性在降解芘的过程中会发生变化,总的趋势是疏水性表面疏水性变小,亲水性表面疏水性变大。获得的一组天然混合菌对芘降解率较低,说明天然混合菌并一定是降解多环芳烃的优势组合菌。另外,多环芳烃降解菌在芘培养液中生长能力和降解能力没有必然联系。(2)采用生物摇床进行单因素试验,对