植物生长素的生物活性及其应用

植物生长素的生物活性及其应用

高等植物的代谢、生长和形态的形成，以及其他生物和非生物的反应系由信号分子决定。植物激素的调节和协调。信号分子通过与特定的细胞蛋白即受体作用而发挥作用。生长素是一种重要的植物激素,包括吲哚-3-乙酸(IAA),是高等植物主要的天然生长素和与IAA作用相仿的相关内源性物质。由于IAA影响植物生长和发展的每个方面,因此IAA被认为是与其他植物激素作用的复杂网络中的重要激素。一般生长素调控细胞的分化、伸长和发育过程,包括微管组织、花分生组织的分化、叶的形成以及花序、衰老和根的形成。在向性反应中,生长素起着重要的作用。早在20世纪40年代,人们就可以合成许多IAA衍生物,有1-萘乙酸(1-NAA)、苯氧羧酸类的2-甲基-4-氯苯氧乙酸(2甲4氯)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-滴)。这些是当今最具有生长素活性的物质之一。这些物质的作用与IAA相同,但时间更长,作用更强,特别是在植物体内更稳定。IAA等天然生长素在植物体内通过共轭和降解等多种途径快速失活。当低浓度作用于细胞位点时,生长素刺激植物的生长和发育。随着植物组织中生长素浓度和活性的增加,植物的生长受到干扰和致命的损坏。因此,对这些合成的类似物的研究来探明生长素在基础研究和应用方面的作用具有重要的意义。合成生长素不仅用作生长调节剂,以增加园艺和农业植物的产量,而且可以作为除草剂控制杂草的危害。在二战后,随着生长素被引入全球市场,被称为生长调节剂或生长素除草剂的2,4-滴和2甲4氯在现代农业中开创了杂草防除的新时代。这些物质有选择性,特别是对谷物作物中的双子叶杂草活性高,具有内吸作用。在过去的几十年中,人们已经合成和商业化了不同种类的生长素除草剂,这些物质具有不同的杂草谱和选择性。目前,生长素包括以下几种类型:苯氧羧酸、苯甲酸、吡啶羧酸、芳氧羧酸甲酯衍生物和喹啉羧酸(图1)。生长素在单子叶植物和双子叶植物间,以及不同的双子叶植物间的选择性不同,重要原因是由于生长素除草剂代谢为无植物毒性物质和对靶标位点敏感的物质所致。具生长素活性的物质,其离解分子的羧基必须带有强的负电荷。合成生长素的生物活性谱不仅受其浓度的影响,还取决于组织的敏感性,主要由组织的类型、生理阶段、植物种类决定,它们的活性谱也可能由不同的信号传导途径介导。当合成生长素被用于除草剂时,它可使植物变形和抑制植物生长,其作用与在组织中以非常高的浓度存在的IAA相同。此现象的产生是由于生长素超剂量或内源性生长素浓度高导致组织内生长素动态不平衡以及与其他激素作用遭到破坏所致。然而,自从Gilbert在1946年提出生长素除草剂能引起敏感植物死亡观点后,此论说一直盛行到近来发现生长素可引起植物生长异常并随之死亡。本文中指出了,生长素可使植物细胞分化和生长异常,导致植物代谢被持续刺激引起生长的缓慢,并致使相关植物生长结构不健全。然而,大多数生长素除草剂具有高的选择性以及很快的作用,但有时在低使用浓度时有立体选择性[即除草活性物质(+)-D-对映体如精2,4-滴丙酸]表明其具有抑制植物生长和使植物死亡的特有的作用方式和机制。1超剂量生长素和植物生长失去了很好的调节作用1.1生长素的激活过程当生长素在植物组织中的浓度不断增加和在植物的分布呈梯度发展时,测定生长素对植物的作用过程,发现生长素除草剂或IAA在高浓度对植物生长调节失控过程分为3个阶段。图2为文献中双子叶杂草中生长素的作用情况。在生长素除草剂用后几个小时内,是生长素刺激植物的阶段,为第一阶段。这个过程包括代谢过程的激活,如诱导芽组织中1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶(1～2h);随后,植物出现生长异常的症状(3～4h),如叶偏上生长、组织肿大和茎卷曲。KlausGrossmann了解到在细胞的伸长中,生长素在数分钟内激活膜离子通道和质膜H+—ATP酶。随后,5～8h后可以在芽组织中检测到脱落酸(ABA)积累。第二个阶段发生在生长素应用后的24h内,包括根的生长抑制和幼芽的生长被最大程度的抑制,伴随节间的伸长降低和叶面积减少,以及绿叶着色加深。同时,发现气孔关闭,呼吸减少,碳同化和淀粉的形成,以及活性氧分子(ROS)的过量产生。第三个阶段是植物衰老和组织衰败的阶段,主要是叶绿体破坏和渐进的萎黄病所致的叶子加速衰老,以及膜和维管系统的完整性遭到破坏,最后植物萎蔫、坏死。所以生长素的刺激和随后的抑制过程都对植物的代谢和生长有影响,由于它们对植物组织持续的高强度的作用,最后除草剂生长素产生毒性作用。从分子角度看,生长素被受体大量地感知,进而调节基因表达以及在细胞伸长过程中快速地激活膜离子通道和质膜H+—ATP酶,这个过程被认为是除草剂的主要作用,结果内源生长素浓度超量。1.2关于aux/iaa的晶体学研究几十年以来,进行生长素分子生物学研究的目的一直为确定受体。在20世纪80年代,用生物化学方法发现与生长素结合的蛋白质1(ABP1)与生长素结合的活性高,是候选受体。后来,对抗生长素或生长素转运抑制剂的拟南芥突变体的基因筛选确定数个遗传位点参与生长素信号传导,如转运抑制剂反应T1R1。最近确定T1R1蛋白为生长素受体,以及发现在ABA生物合成中在生长素、乙烯和9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)的上调的信号传输中存在一种新的激素相互作用方式,为生长素除草剂介导的作用的主要部分(图3)。F-box蛋白T1R1是SCF复合体为(Skp1-Cullin1-F-box)E3泛素连接酶的一个重要组成部分,亦为蛋白质降解泛素蛋白酶体途径的一部分。T1R1的底物Aux/IAA转录阻遏蛋白以生长素依赖方式与T1R1结合。结合后,阻遏物被降解。对以上相互作用进行晶体学分析表明,IAA结合到同一个T1R1孔穴的基部,使Aux/IAA蛋白停靠在IAA的顶部,这占据了T1R1孔穴的其他部分。在这方面,IAA作为“分子黏胶剂”增加了T1R1-AUX/IAA蛋白的相互作用力。为了验证T1R1是感知生长素的主要受体,对合成的IAA类似物、2,4-滴和1-NAA进行了试验。试验表明T1R1也与这些合成生长素结合。此外,与生长素配体IAA、2,4-滴和1-NAA有关的T1R1晶体结构表明,IAA与T1R1受体孔穴基部的部分兼容位点结合,这也能为合成的生长素提供空间。有趣的是,IAA以最大的亲和力与T1R1结合,结合部分包括侧链羧基基团和环。计算机模拟的T1R1结构表明合成的其他类型的生长素,包括苯甲酸类的麦草畏,喹啉羧酸类的二氯喹啉酸和精喹禾灵,它们也符合生长素与受体的空穴结合理论。最后,IAA或合成生长素与T1R1结合使Aux/IAA阻遏物与受体的相互作用稳定,这促使SCF复合体以共价方式使泛素与Aux/IAA蛋白结合,表明T1R1作为底物被265酶蛋白体降解。Aux/IAA阻遏物蛋白的损失导致现有的DNA结合的转录激活蛋白受体,即生长素相应因子(ARFs)的抑制被解除。它们不断地激活生长素反应因子基因转录,包括乙烯生物合成中的1-氨基环丙烷-1-羧基酸(ACC)合成酶,反馈抑制作用的Aux/IAA阻遏物以及在组织中生长素浓度保持高水平。拟南芥基因组编码有5个T1R1同类物,其中3个物质,生长素结合F-box蛋白AFB1,AFB2和AFB3也介导生长素的反应。所以,拟南芥tir1afb1afb2afb3四倍突变幼苗对生长素不敏感,表现出严重的发展和形态表型。这表明4个同类物一同调节植物对IAA和2,4-滴的反应。此外,已发现T1R1同系物AFB5的突变体有抗性,特别是对吡啶类羧酸生长素除草剂有抗性,对2,4-滴或IAA只有很低的交互抗性,表明生长素对不同类型生长素除草剂的化学专一性主要是由不同生长素受体蛋白引起。然而,是否T1R1受体家族能解释所有生长素的化学信号多样性和生物活性取决于组织的敏感性、生长阶段和植物生物型和种类,这些问题还有待研究。这也包括是否生长素除草剂的选择性是由单子叶和双子叶植物体内的受体不同所致。Aux/IAA阻遏蛋白和ARF转录因子的多样性和组织专一性能说明生长素特有反应过多。此外,许多生长素反应由转录介导,因此与T1R1受体家族相关。然而,在快速的生长素响应中,如在细胞扩展中生长素诱导的离子流,一种信号传导途径,它可能是由与生长素结合的膜结合蛋白1(ABP1)与相关的蛋白进行传导。ABP1可能与植物自有的影响ABP1作用的生长素协调细胞的分化和扩展。1.3生长素国际农艺抑制剂对植物生长和酶活性的影响新发现的T1R1/AFB受体与高浓度的生长素除草剂或IAA结合,会导致转录因子丰富和生长素反应基因的过渡表达,随后依次产生一系列与除草剂作用有关的生化和生理反应。在本文中,当生长素被用于敏感植物或其在转基因植物中过量生成时,在植物的生物合成中,它诱导ACC合成酶过度刺激ACC和乙烯的形成是人们早已知道的早期普遍存在的反应。ACC同工型合成酶是受多基因ACS家族编码,它们是早期生长素效应基因。在IAA和生长素除草剂应用后的数分钟内,它们的表达不同,或转录后或翻译后受IAA和生长素的调控。生长素诱导的ACC合成酶活性导致ACC浓度的快速上升,与之紧密相关的是乙烯生成增加。在试验中,使用含有ACC合成酶反义基因LE-ACS2的转基因番茄,和抗生长素或乙烯不敏感品系植物(拟南芥、野生芥菜、番茄),除草剂诱导的形态症状减少或情况完全相反。乙烯是气体激素,它参与植物对外界环境胁迫的反应,调节植物衰老和生长。乙烯使微管从横向向纵向排列,促进侧向细胞扩展,导致植物茎和根长粗。此外,乙烯还调节生长素的作用,如叶的脱落和偏上性,通过抑制生长素的转运调节植物固有的生长素的水平。所以,生长素诱导的乙烯快速的产生是植物生长异常和衰老的原因(图3)。涉及生长素抑制植物生长和其植物毒性的重要因素是ABA的过渡生成。在生长素诱导ACC合成酶活性和乙烯形成后,ABA在根和幼芽中积累,其浓度是对照的70倍。试验表明与不同种类的生长素除草剂和IAA抑制植物幼芽和根生长关系密切,它们诱导许多双子叶植物产生ABA,这些植物包括茜草科、茄科、伞形科、豆科、玄参科和旋花科。相比,对生长素除草剂有天然抗性的作物在生长素的作用下ACC合成酶的活性并无提高,ABA的含量也没有改变,这表明生长素很可能选择性地作用于受体。例如,IAA和生长素除草剂促进高度敏感的双子叶植物鹅草体内ABA的生物合成。在用生长素处理的鹅草细胞的悬浮液中,处理后3h,ABA的浓度就增加了,这说明激素信号传导后植物直接产生反应。对反应途径中间体的分析表明增加叶黄素的裂解可特有地诱导幼芽中ABA的生物合成,增加ABA前体黄氧素的产生。此途径中主要的调节环节受质体酶NCED催化,此酶被NCED基因编码。通过对使用生物合成抑制剂或感知缺陷的番茄突变体,或乙烯或ABA的合成的方法进行研究,结果表明生长素刺激产生的乙烯是ABA积累的触发器。最近,KlausGrossmann对猪殃殃属植物体内生长素诱导的GaNCED1基因的表达和乙烯及ABA的生物合成的时间进程进行了研究,结果为在根被处理后的1h内,IAA和不同种类生长素除草剂,包括氯甲喹啉酸、麦草畏和毒莠定(图1),只使幼芽中CaNCED1mRNA的含量暂时增加。处理后3h,转录水平达最大值,是对照的40倍,此后其水平下降。在此期间,幼芽中水含量和渗透势没变,这表明GaNCED1基因表达不因生长素介导的膨压变化而增加。ABA开始增加的时间要滞后2h,在24h后其浓度是对照的24倍。有趣的是,GaNCED1转录水平的增加早于其在ACC合成酶活性,ACC和乙烯的产生。所以,乙烯或ACC不是NCED基因激活的主要触发器。据此,所用的乙烯生物合成抑制剂对GaNCED1基因表达的影响较小。然而,乙烯抑制剂较大程度地减少了生长素诱导的ABA的积累,这说明生长素诱导的乙烯是ABA积累所必需的,但在NCED基因表达中的作用较小。总的来说,IAA和生长素除草剂先刺激乙烯生物合成中的基因表达,后直接激发NCED的基因活性,这是上调ABA生物合成(图3)所需要的。然而,至于在NCED基因表达中生长素信号传导是否也涉及SCF介导的转录遏阻物的降解,如Aux/IAA,这个问题仍未知晓。同样,生长素对NCED基因表达的诱导是否是生长素对敏感植物的普遍的作用,此还需进一步的研究阐明。已发现在不同的双子叶植物中生长素能诱导ABA积累,所以这种情况可能性很大。生长素是NCED基因表达的主要触发物,而由于转录后NCED的上调使乙烯促进ABA的生物合成。乙烯介导NCED活性的增加可能是基于酶蛋白合成、活性和/或稳定性增加的缘故。据此,对2,4-滴处理的拟南芥转录物组分析表明NCED1的表达和基因参与了乙烯的信号传导和生物合成。最后,ABA在幼芽组织中积累和在植物内系统地转移。在生长素的作用中(图3),ABA和乙烯是激素第二信使。ABA被作为促进叶片衰老和控制植物生长的一个重要激素,它影响植物气孔的运动和细胞的分化和扩展。事实上,ABA在植物体内的增加过程和气孔的关闭,以及随后的呼吸受抑制、二氧化碳的同化、植物的生长以及渐进的叶组织破坏有密切的关系。其后面的作用伴随着活性氧(ROS)的过量生成,如过氧化氢,是受光合活性的下降所触发,而光合活性的下降是由于ABA介导的气孔关闭所致。此外,ABA诱导激活的质膜NADPH氧化酶可能参与过氧化氢的生成。而Cu/Zn超氧化物歧化酶在叶组织中的量增加,进一步促进了过氧化氢的积累。外来的ABA对以上过程的作用类似于生长素。这与已知的ABA在气孔关闭、生长抑制和促进叶衰老的激素作用一致。比较不同种类生长素除草剂的作用,会发现ABA和ROS的过量生成,如超氧自由基和过氧化氢,同时植物组织的破坏是所有生长素除草剂的常见作用。过氧化氢的积累一般被认为导致膜脂过氧化和可能的衰老过程信号传导,而有助于氧化组织的破坏。相应地,用过氧化氢处理猪殃殃属植物的幼芽,幼芽出现了与生长素除草剂同样的植物毒性症状,如叶片黄化,随后枯萎,组织坏死,和植物死亡。总的来说,生长素的作用和生长素刺激产生的乙烯和ABA是生长素除草剂和IAA在高于内源的浓度时对植物产生毒性的主要原因。特别是,ABA和过氧化氢的过量产生是生长素作用和植物生长受抑制、衰老和组织腐烂的之间长期探究的关系。所以,在生长素感知和信号传导中激素相互作用方面通过合成生物素研究,确定了新的作用原理,认为激素的相互作用在对植物生长调节中生长素和乙烯和ABA生物合成的上调之间发挥作用。此外,相关的结果使人们认为激素的相互作用也是其他相关的生长素作用的信号传导的模式,如根向地性、顶端优势对侧芽的抑制。当乙烯和ABA信号传导链呈现部分重叠和干扰时,乙烯和ABA间相互作用对乙烯生物合成有很强的刺激作用。这些包括胁迫条件诱导的衰老,细胞激动素引发的生长抑制,根癌农杆菌诱导的植物肿瘤的发生和果实的成熟。2生长素消毒中的氰化物作用2.1生物活性化合物生长素除草剂能较好地控制双子叶杂草,但选择性生长素除草剂二氯喹啉酸例外,它还能防除水稻田重要的禾本科杂草,如稗属、马唐属和狗尾草属杂草。它引起的主要症状是抑制植物生长,表现为首先最新长出的叶片的生长区域不断褪色,随后,整个幼芽萎蔫、坏死。对二氯喹磷酸对禾本科杂草的作用机制研究表明它诱导ABA和过氧化氢的增加不足以导致这些症状的产生。Tittle等人报道首次表明在刺激的乙烯生物合成过程中产生的副产物氰化物在生长素除草剂2,4-滴的作用方式和选择性方面的作用。然而,试验表明二氯喹啉酸作为生长素除草剂以相似的方式对禾本科杂草有防除作用。2.2产业资源模拟氰化物在自然界普遍存在,它可由广泛分布的多种前体形成。约2500多种植物能产生氰化物,也就是说能产生氰化氢(HCN)。生氰作用在双子叶植物(如石榴和豆科植物)和禾本科杂草中普遍存在,包括重要的粮食作物如玉米、水稻、小麦和大麦。大多数植物产生氰化氢的机制是氰苷的降解。60多个氰苷已为人们所知,而且被认为可以防御食草动物,作为糖和氮的储藏物质,它们的苦味和释放有毒的HCN通过干扰组织的功能来达到防御作用。此外,有报道可在氨基酸氧化酶和过氧化物酶作用下由组氨酸形成氰化氢,由盐酸盐同化作用可能生成中间体羟胺,和由光呼吸产物乙醛酸形成氰化氢。自20世纪80年代早期发现氰化物是植物激素乙烯生物合成过程中产生的副产物以来,有人就提出了此代谢物在植物中的重要生理作用。2.3细胞毒性活性产生的氰化物在化学量上与乙烯的相等。1-氨基环丙烷甲酸(ACC)在ACC氧化酶的作用下氧化产生乙烯、CO2、HCN。乙烯合成反应的广泛存在表明此途径是许多植物体内内源自由氰化物的主要来源。乙烯对植物的多方面的生理发育有重要的调节作用,如生长、衰老和成熟,而氰化物则是一个对植物有毒的物质。它是一个众所周知抑制剂,特别对金属酶和其他蛋白质的抑制活性高,这些酶参与氰化物和希夫碱中间体或底物反应生成抑制活性化合物的反应。这些酶参与植物的一些重要的代谢过程,如呼吸、碳和氮的同化、碳水化合物的代谢和防御减毒氧反应。氰化物也与铜蛋白质体氰相互作用,抑制光合成电子传递。对氰化物最敏感的酶有硝酸盐/亚硝酸盐还原酶、固氮酶、过氧化氢酶、Cu/Zn超氧化歧化酶、过氧化物酶、二磷酸核酮糖羧化酶和细胞色素氧化酶。对敏感酶的抑制率为50%的内源性氢化物的浓度一般为5～10μM。高等植物中使HCN去毒的主要酶为氰丙氨酸合成酶(CAS),它是磷酸吡哆醛依赖性酶,催化半胱氨酸和氰化物反应生成H2S和氰内氨酸(图3)。氰丙氨酸随后在氰丙氨酸水解酶作用下转化为天冬酰胺。在老的植物组织和有分生组织活性植物部位发现氰丙氨酸合成酶的活性高,这和氰化物的产生以及乙烯的浓度有关。乙烯和氰化物能影响氰化物的产生和代谢。乙烯能影响其自身的生物合成,因此通过增加(自动刺激)或降低(自动抑制)乙烯的生成速率影响其副产物氰化物的生物合成。乙烯能调节ACC的合成酶和ACC氧化酶的活性在转录或转录后水平,能诱导氰丙氨酸合成酶的合成。已发现氰化物能上调ACC合成酶基因表达,催化激活和钝化ACC氧化酶反应,增加氰丙氨酸合成酶活性。然而,细胞内ACC氧化酶是唯一一个细胞胞浆酶,因此其反应产物乙烯和HCN最初被释放到细胞质中。而氰丙氨酸合成酶主要分布在线粒体中。因此,氰化物在细胞内不同点的释放和氰化物的失活导致氰化物在细胞内分布不均。清除在植物线粒体外的细胞隔室中氰化物的效果可能不佳,且能导致细胞隔室中氰化物的浓度迅速直线上升,如在细胞质中和叶绿体中。线粒体中氰化物的有效脱毒能特有地保护氢化物敏感性呼吸中的细胞色度c氧化酶,阻止ROS的形成。然而,其他高敏感性酶如硝酸还原酶和Cu/Zn超氧化歧化酶位于细胞质中,而二磷酸核酮糖羧化酶分布在叶绿体中,过氧化氢酶在过氧化质体中。这使它们对氢化物抑制剂更敏感,因为氰化物在细胞中的移动性很高。在25℃溶液中氢氰酸的pka值约为9.2。当细胞内pH约为中性时,在ACC氧化酶反应存在时大部分氰化物以非游离态释放。其为非离子,亲脂性高,因此能较易地穿过膜进入细胞隔室。HCN在细胞内浓度瞬间升高时不均的分布,导致在细胞中达到具有毒性的浓度,可能对代谢有多种影响,氰化物引起植物死亡。然而,由于人们已发现在产生大量(即1650nmol/g·h)乙烯的植物组织中测到高活性的β-CAS,以及组织中氰化物的浓度低于对敏感酶的非毒性浓度,因此Yip和Yang认为植物组织足可以使乙烯生物合成中生成的HCN解毒。所以,在过去氰化物在植物体内可能的代谢和生理作用被忽略。在20世纪90年代,在对生长素除草剂的作用方式的研究中重新检验了这个问题,研究了被刺激的乙烯和氰化物的生物合成参与诱导细胞和植物死亡的情况。2.4氰化物对植物的影响首先以禾本科杂草稗草为例,二氯喹啉酸主要的作用位点在根部,但内源ACC的量、乙烯的形成和氰化物的积累的增加主要发生在植物的幼芽,此部位是症状表现之所在。二氯喹啉酸只诱导植物根部ACC合成酶的活性,使ACC的量在处理后1h增加(图3)。过量的ACC被转移到植物的幼芽,在ACC氧化酶的作用下被转化为大量的乙烯和氰化物。由于ACC和氰化物诱导幼芽中ACC合成酶活性增加,所以过程有自我放大作用。用ACC对从稗草分离的幼芽进行处理(通过对维管的作用)后,增加了ACC合成酶和乙烯和氰化物的生成量。用1mMACC处理后6h,ACC合成酶的活性是对照的5倍。在培养的53h中,组织中氰化物的浓度由5μM增加到18μM。此外,应用的氰化物可能通过诱导ACC合成酶基因的转录,使幼芽中ACC合成酶活性增加。对于其他敏感的杂草,如马唐、宽叶臂形草和狗尾草,幼芽中氰化物的浓度也增加。增加的程度与除草剂的浓度、应用次数有关,与除草剂的作用也密切相关,如杂草生长受抑制情况、叶绿素的减少和碳的同化作用。同时,发现增加了内源的氰化物的浓度,在稗草和马唐的幼芽中分别增加了3倍和9倍,在处理后96h达到了最大值,分别约为30和50μM。其他类型的生长素除草剂,包括麦草畏和1-