二妙丸类方配伍物质基础研究

二妙丸类方配伍物质基础研究

二益丸（pm）引用朱振恒的医学素描，包括黄柏和白术。这是一个潮湿和清热的经典方剂。三妙丸(S3M)是在EM基础上加牛膝以活血化淤通络,补肝肾强筋骨,专治下焦湿热之痹证。四妙丸(S4M)在S3M基础上加薏苡仁,以增强祛湿热而利筋络之力,主治湿热下注之痿证。临床常用S4M加味治疗急性痛风,S4M加清热药(忍冬藤和土茯苓)即加味四妙丸(GSM),是抗湿热证痛风的有效方剂。它们均是EM类方,又依次为基础方和类方,临床治疗湿热下注证的各种病症。EM作为基础方,其有效部位主要由苍术挥发油、黄柏生物碱组成,其中生物碱由小檗碱(批号713-9906)、巴马汀、药根碱、黄柏碱、木兰花碱等组成,具有抗炎和免疫抑制作用;牛膝、薏苡仁的有效部位为皂苷类等成分;土茯苓和忍冬藤两加味药中主要有黄酮类、有机酸类成分,其中土茯苓中落新妇苷等黄酮类成分,具有抗炎、镇痛、利尿作用,忍冬藤中的绿原酸具有抗炎、抑菌作用。GSM抗痛风有效部位群由挥发油、生物碱、黄酮、有机酸、皂苷和糖类组成,系统比较二妙丸类方及其有效部位群抗湿热证痛风生物效应显示,从基础方到类方,效应的变化存在着一定的联系和规律。为进一步研究二妙丸类方物质基础配伍变化规律,作者建立了能充分反映生物碱、黄酮、有机酸等成分信息的GSM有效部位群HPLC指纹图谱,比较二妙丸类方指纹图谱共有峰成分特征及配伍变化。1药代动力学及药鉴定高效液相色谱仪Agilent1100,含在线真空脱气机、高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、Agilent1100化学工作站等。黄柏PhellodendronchinenseSchneid.、苍术AtractylodeschinensisKoidz.、薏苡仁CorxLacryma-jobiL.var.mayuen,牛膝AchyranthesbidintataBl.、忍冬藤LonicerajaponicaThunb.、土茯苓SmilaxglabraRoxb.6味药均自购,由南京中医药大学药学院中药鉴定教研室王春根教授鉴定。绿原酸(批号110753-200413)、药根碱(批号0733-200005)、小檗碱(批号713-9906)、巴马汀(批号110713-200208)、落新妇苷(自制,HPLC峰面积归一化法纯度>98%)、紫丁香苷(批号111574-200201)等购自中国生物制品检定所(批号)。甲醇(色谱纯),冰醋酸(分析纯),娃哈哈纯净水,其他制备试剂为分析纯。2方法和结果2.1小球物提取物的制备对照品样品制备:将对照品精密称量后,甲醇定容,配制成0.1g·L-1对照品供试液;将对照品溶液加入加味四妙丸有效部位群溶液中,配制成对照品供试液。黄柏生物碱提取物:按文献方法,黄柏醇提后,经大孔树脂纯化得生物碱提取物,纯度为64.5%。按文献方法制备二妙丸类方有效部位群,正丁醇萃取,回收溶剂后用80%甲醇定容,其中二妙丸类方有效部位群(EMP,S3MP,S4MP,GSMP)样品配制质量浓度为0.4g·mL-1;黄柏生物碱、土茯苓黄酮、忍冬藤黄酮、忍冬藤有机酸配制质量浓度为1g·mL-1。苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁、土茯苓、忍冬藤各称取10g,甲醇浸泡过夜,超声0.5h,过滤,取滤液定容10mL,制备成1g·mL-1样品。2.2萃取流程及检测波长lmKromasilC18色谱柱(4.6mm×200mm,5μm);流动相A-甲醇,B-1.5%的醋酸水溶液;梯度洗脱程序为0～60min,10%～45%A;60～85min,45%～75%A;85～95min,75%～85%A;95～100min,85%～10%A;流速0.8mL·min-1;检测波长280nm;柱箱温度30℃;进样量10μL;分析时间100min。2.3方法研究2.3.1准确度的研究2.3.2审查的重复2.3.3稳定性试验2.4gsmp指纹图谱按2.1项下方法制备10批GSMP样品,2.2项下色谱条件测定色谱图,制订指纹图谱技术参数。其中保留时间及峰面积相对稳定的60个共有峰峰面积占总峰面积90%以上,确定为GSMP指纹图谱共有峰,见图1。与对照品比对,第39个共有峰(tR49.0291min)是巴马汀,定作参照峰。计算其他各共有峰相对保留时间和相对峰面积比值,按其相对保留时间定性,各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.5%,其中占峰面积10%以上的15,18,19,27,33,37,39,40号峰的相对峰面积的RSD均小于3%。2.5加味四妙丸加味液的峰面积变化2.2项下色谱条件测定对照品、组方药及其有效部位色谱图,与GSMP指纹图谱对比见图2。根据各色谱峰相对保留时间比值比对,以及对加入定量对照品的与未加入定量对照品的加味四妙丸供试液的峰面积变化进行对比,确定第14,28,37,43,51号峰来源于土茯苓黄酮部位,其中,37号共有峰为落新妇苷;第4,34,38,44号峰来源于忍冬藤黄酮部位;第17,18,46号峰来源于忍冬藤有机酸,其中,第18号峰为绿原酸;第20号峰为黄柏中的紫丁香苷,第11,21,23号峰来源于牛膝,第7,54号峰来源于薏苡仁,其余42个共有峰来源于黄柏生物碱部位,其中,36号峰为药根碱,39号峰为巴马汀,40号峰为小檗碱。2.6emp和固相配伍分类按2.2项下色谱条件测定EMP,S3MP,S4MP,GSMPHPLC指纹图谱,叠加图见图3,二妙丸类方与基础方二妙丸有效部位群的指纹图谱特征相似。EM基础方与类方有效部位群共有峰及其相对峰面积比值见表1。EMP指纹图谱43个共有峰来源于黄柏,其中42个共有峰来源于生物碱部位;S3MP指纹图谱共有峰在EMP基础上增加了3个牛膝共有峰;S4MP指纹图谱共有峰在S3MP的基础上增加了薏苡仁2个共有峰;GSMP指纹图谱共有峰在S4MP的基础上增加了加味药14个共有峰,来源于加味药黄酮和有机酸类部位。基础方EM配伍类方后,生物碱部位共有峰相对峰面积有一定的变化趋势。小檗碱在配伍后相对峰面积比值相对稳定;药根碱,8,9,22,24,25,26,30,31,32,33,35,41,45,47,49,50,52,53,56,57,59,60号共有峰配伍牛膝(S3M)、薏苡仁(S4M)后,相对峰面积比值减小,配伍土茯苓、忍冬藤后(GSM),相对峰面积增加;10,12,13,16,20,29,42,48号共有峰配伍牛膝(S3M)、薏苡仁(S4M)及加味药(GSM)后,相对峰面积有减小趋势;1,2,3,5,6,15,19,27,55号峰共有峰在S3M,S4M,GSM中相对峰面积有增加的趋势。EM配伍牛膝、薏苡仁后,多数共有峰有增加的趋势。3妙丸类方有效部位指纹图谱的建立及应用测量方剂配伍规律是中医药理论的特色和关键,以经典方作为基础方,按其制方规范加减配伍所形成的多种类方在临床上应用较多。将传统医学理论与现代科技相结合,研究经典方与其类方的药效物质基础变化规律,阐明类方方剂配伍规律的科学内涵,是探索方剂配伍规律的重要途径之一。中药复方化学成分复杂,而以有效部位为药效物质基础的基本单元,利用现代色谱分析技术,测定有效部位指纹图谱,符合中药药效物质基础整体性和模糊性的特征要求。在GSMP指纹图谱中,主要共有峰来源于二妙丸生物碱部位,因此,二妙丸及其3个类方指纹图谱具有很大的相似性。牛膝、薏苡仁有效部位为皂苷,在该指纹图谱中不能反映出来,S3MP,S4MP指纹图谱增加的共有峰较少,而GSMP指纹图谱中,增加的共有峰来源于加味药中黄酮和有机酸有效部位。本研究是以巴马汀为参照峰,其他共有峰是按相对峰面积比值进行比较,因此,生物碱部位的共有峰是相对与巴马汀相对峰面积的相对变化。多数生物碱部位共有峰在配伍S3M,S4M后相对含量减少,与前人研究一致。作者通过建立GSMPHPLC指纹图谱,比较二妙丸类方有效部位群生物碱、黄酮、有机酸有效部位成分信息的特征及其差异,探索类方方剂物质基础的表征途径。要全面表征二妙丸类方有效部位群物质基础特征,还需进一步表征挥发油、皂苷等有效部位成分特征,并用现代统计分析方法研究多成分-配伍-效应变化的相关性。取GSMP供试品,连续进样6次,按2.2项下色谱条件测定色谱图,各共有峰相对保留时间RSD均小于0.5%,占总峰面积10%以上的共有峰相对峰面积RSD均小于3%,表明精密度良好。按2.1项下方法制备6批GSMP供试品,