高铁血红蛋白含量测定的意义

高铁血红蛋白含量测定的意义

血液（hb）是一种重要的高生物随机氧的蛋白质。人体内的血红蛋白由4个亚基构成,每个亚基由4条肽链和4个血红素分子构成,血红素的核心是亚铁离子。血红蛋白发挥载氧功能时,亚铁离子与氧结合,化学价不变,形成氧合血红蛋白。血红蛋白能从氧分压较高的肺泡中摄取氧,并随着血液循环把氧气释放到氧分压较低的组织中去,从而起到输氧作用。血红蛋白分子内的亚铁离子氧化为正铁离子后,即成为高铁血红蛋白(methemoglobin,MetHb)。MetHb与氧结合不稳定,与羟基或氯化物牢固结合,丧失了携带氧和释放氧的能力。人体正常生理活动中,每日约有3%含有亚铁离子的血红蛋白被氧化为含正铁离子的MetHb。但在红细胞内含有4种抗氧化物质,NADH-MetHb还原酶,NADPH-MetHb还原酶,还原型谷胱甘肽和维生素C。这4种抗氧化物质通过不同途径将大部分MetHb还原,使血液中的MetHb含量维持在0.5%以下,其中以NADH-MetHb还原酶的途径为主(占全部还原过程的67%)。血液中MetHb含量超过1%时,成为高铁血红蛋白血症。引起高铁血红蛋白血症的常见原因有3种:①接触亚硝酸钠、硝酸铵、硝酸钾等化学试剂;②NADH-MetHb还原酶缺乏;③常染色体显性遗传。高铁血红蛋白血症的临床表现为发绀、呼吸困难、头晕等,重者将引起死亡。MetHb含量测定对高铁血红蛋白血症的诊断具有重要的临床意义。此外,MetHb含量测定还广泛应用于红细胞代用品的研制中。红细胞代用品是指具有载氧功能、维持血液渗透压和酸碱平衡、扩充血容量的人工制剂。基于血红蛋白的氧载体(hemoglobin-basedoxygencarriers,HBOCs)是目前研究较多的一类红细胞代用品。HBOCs多为无基质血红蛋白溶液,缺乏红细胞内含有的还原酶类,亚铁离子极易氧化为正铁离子。美国FDA已将MetHb含量列为HBOCs产品的必检指标。本文将对MetHb含量测定方法进行综述。1methb含量测定数十年来,对MetHb含量测定方法的研究大部分针对血液样品,针对HBOCs的研究较少。随着对HBOCs研究的深入,其MetHb含量测定方法不断完善。MetHb含量测定方法有很多种,分为三大类,几乎所有方法都以朗伯-比尔定律(Lambert-Beer′sLaw)A=ε×C×1为基础。1.1检测methb含量该类方法是基于弱酸性MetHb加入氰化物后形成氰化MetHb(MetHb·CN),在630nm处的特征吸收峰会消失。根据加入氰化物前后光密度的变化量来计算MetHb的含量。光密度的变化量与MetHb的含量成正比。其中MetHb的特征吸收峰通常选择630nm或635nm。比较经典的方法由加拿大学者Evelyn和Malloy于1938年建立,又称Evelyn-Malloy法。主要实验步骤为:①将草酸钾抗凝血液0.1ml加入10mlpH6.6的低渗磷酸盐缓冲液;②溶液混合后静置5min,用水作空白对照,测定溶液在635nm处的光密度L1;③向溶液中加入1滴中性氰化钠溶液,将MetHb全部转化为MetHb·CN,反应2min后,测定光密度L2。(L1-L2)的值与MetHb含量成正比。根据公式CMetHb=100(L1−L2)2.77CΜetΗb=100(L1-L2)2.77计算MetHb的含量,单位为“g/100ml血液”。其中,利用带有滤色玻片的光电比色计来测量光密度。结果的最大误差不超过0.2g/100ml,通常为0.1g/100ml。最低检测限是0.2g/100ml,因为血液100倍稀释后在静置过程中,会自动缓慢形成MetHb。本测定方法基于光密度的变化,除MetHb外其他成分在加入氰化物前后光密度不发生变化,结果准确度不受溶液中其他成分的影响。该方法不足之处是检测灵敏度和稳定性较差。在得到MetHb含量的基础上,向样品中加入过量高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]和NaCN,将血红蛋白全部转化为MetHb·CN,在540nm处测定并计算总血红蛋白的(totalhemoglobin,tHb)含量CtHb。CMetHbCtHb×100%CΜetΗbCtΗb×100%即为MetHb的百分含量。在Evelyn-Malloy法的基础上,研究者们进行了诸多改进,提高了测定结果的准确度和灵敏度。与Evelyn-Malloy法不同,Hegesh等将样品进行溶血预处理,分离提取血红蛋白后测定MetHb含量,提高灵敏度,同时延长预处理后样品在4℃的保存时间至24h;为了使样品中Hb的自动氧化减小到最低限度,降低检测限,Leahy等减少样品稀释倍数,Rodkey等通过快速溶血,调节pH值至6.9,并降温至0℃。对于碳氧血红蛋白(carboxyhemoglobin,HbCO)含量高的样品,高铁氰化钾很难使HbCO完全转化为MetHb,测得tHb含量比实际值偏低,从而使MetHb含量比实际值偏高。Sato等通过实验证明,加入100倍过量的高铁氰化钾,可以将高含量的HbCO完全转化为MetHb。氰化物法是目前公认测定MetHb含量的方法。其后建立的新方法通常以氰化物法为标准确定准确度。但是,高铁氰化钾水溶液遇光即分解形成亚铁氰化钾而失去氧化能力,氰化物遇酸或紫外线照射可产生剧毒的HCN气体,试剂保存时间短,所以,氰化物法不适合临床样本的检测以及HBOCs的在线检测。1.2计检测d2、d3、methb的方法计算分光光度法是通过分光光度计直接测定样品在多个波长处的光密度来计算MetHb的含量。主要有三波长法、四波长法和连续波谱法。三波长法是1973年由Benesch等建立,将样品溶血预处理,释放Hb,分别测定Hb溶液在560、576、630nm处的光密度D560、D576、D630。根据Lambert-Beer定律A=ε×C×1,得到3个方程式Dλ1=εDλ1CD+εOλ1CO+εFλ1CF;Dλ2=εDλ2CD+εOλ2CO+εFλ2CF;Dλ3=εDλ3CD+εOλ3CO+εFλ3CF。其中,D:光密度;CD、CO、CF:脱氧血红蛋白(deoxyhemoglobin,DHb)、氧合血红蛋白(oxyhemoglobin,HbO2)和MetHb的摩尔浓度;λ1、λ2、λ3:560、576、630nm,分别是DHb、HbO2、MetHb的最大吸收峰;ελ:特定波长下的消光系数。3个方程式求解得到DHb、HbO2和MetHb的摩尔浓度。三波长法可以准确测定MetHb含量低的样品。该法不足之处为ελ受溶液pH值影响大,不同pH条件下需要选择不同的ελ。Zijlstra等建立的四波长法是指加入皂苷溶液将红细胞溶血后,直接测定样品在562、558、540、523nm处的光密度,以Lambert-Beer定律为基础计算得到MetHb含量。该方法用于测定含有HbO2、HbCO和MetHb3种成分的样品。连续波谱法是丹麦Radiometer公司ABL80血气分析仪采用的测定方法。测定样品在467~672nm范围内的光密度,选择其中的138个波长以Lambert-Beer定律为基础计算得到MetHb含量。计算分光光度法只需加入皂苷溶液或缓冲液将红细胞溶血释放Hb,即可直接测定样品的光密度。操作简单,快速,不使用氰化物。计算分光光度法原理多被各种血气分析仪采用。1.3血压法提取微囊中methb含量检测等吸收点是指相同浓度的两种物质在某波长处的光密度相同。例如,相同浓度的完全还原Hb和完全氧化的MetHb吸收光谱在590nm处相交,即两者的光密度相同,当样品总浓度相同,还原的Hb与MetHb比例不同,在590nm波长处的光密度与完全氧化或还原的Hb光密度亦相等。可以利用等吸收原理来计算MetHb的含量。刘兰廷等根据MetHb在635nm处有特征吸收峰及在590nm处与血红蛋白相交的特点,同时在635nm与590nm处测量样品的光密度。按照公式MetHb%=Ex−rEE(R−r)×100%=Ex-rEE(R-r)×100计算MetHb的含量。其中,EX、E分别为样品在635nm与590nm处的光密度读数;R为100%MetHb在635nm与590nm处的光密度比例常数;r为100%血红蛋白在635nm与590nm处的光密度比例常数。该方法有2个缺点:①r值误差较大,制备100%血红蛋白溶液是利用中性NaCN与MetHb作用形成MetHb·CN,消除MetHb在635nm处最大吸收峰原理,但是MetHb·CN存在干扰,使r值误差较大;②590nm处Hb和低浓度MetHb吸收曲线较陡,各种误差因素对590nm处的光密度值影响较大。以上介绍的所有测定方法均适用于天然血液样品的检测。将红细胞破碎或溶血,释放血红蛋白到缓冲液中后进行MetHb含量的测定。有研究者认为,这些方法对于一种新型HBOCs——血红蛋白微囊(hemoglobinvesicles,HbVs,或称“人工红细胞”)则不适用。利用磷脂双分子膜包裹高浓度的血红蛋白分子形成的细胞状微粒体,称为HbVs。破坏微囊测定MetHb含量会引起Hb变性或出现膜破坏不完全等问题。日本的Hamada等利用等吸收点建立了一种新的测定方法,不需要破坏微囊而直接测定。根据相同浓度下MetHb与DHb在355nm及456nm处光密度均相等,连接等吸收点355nm与456nm得到一条直线,作为基线。由于MetHb与DHb分别在405nm、430nm处有特征吸收,分别求得405nm和430nm处的峰值D405和D430做检测线。制备MetHb含量分别为100%和0%的试剂,变化这2种试剂的混合比例,测定混合溶液的光密度,并计算D405和D430。分别以[MetHb]-D405,[MetHb]-D430作线性方程,得到D405=0.49×[MetHb]+9.8;D430=51-0.44×[MetHb]。求解得到[MetHb]=(51X-9.8)/(0.44X+0.49),其中X=D405/D430。该计算公式与样品的粒径、包封率有关,对于不同的样品要重复上述操作,得到不同的[MetHb]计算公式。等吸收点法较氰化物法安全,适用于血液样品和HBOCs产品中MetHb含量的测定,其测定原理有望应用于所有样品的MetHb含量测定。除了以上总结的三类方法外,还有一些其他的MetHb含量测定方法。如通过测定水溶剂质子核磁共振(NMR)弛豫率来计算MetHb含量、利用MetHb冰冻溶液中正铁离子高度自旋产生的零场分裂、使用拉曼光谱监测铁离子低自旋态与高自旋态特征峰强度以检测MetHb含量,这些方法相对复杂,且检测仪器昂贵,因此应用较少。2methb-s的应用2.1methb的测定目前,HBOCs产品类型主要包括聚合Hb、分子内交联Hb、共轭Hb和HbVs等。对于国外HBOCs产品的MetHb含量测定方法,没有明确的文献报道,但在HBOCs产品的药效学研究中,一般采用血气分析仪测定样品的MetHb含量。如戊二醛聚合Hb产品HBOC-201,使用IL482cooximeter(InstrumentationLaboratories)测定MetHb含量;双阿司匹林分子内交联Hb,使用cooximeter分析仪测定;由聚乙二醇修饰得到的PEG-Hb,使用血气分析仪Hemoximeter(Radiometer,Copenhagen)测定;日本的Hamada采用等吸收点法测定HbV中MetHb含量。国内研究载牛血红蛋白纳米微囊(Hb-loadednanoparticles,HbP)具有多孔结构,允许小分子自由扩散,测定微囊内MetHb含量采用氰化物法。2.2正常项目和方法检测methb含量每一种MetHb含量测定方法都有其自身局限性,并不适合于所有样品。HBOCs中血红蛋白分子与天然血红蛋白分子结构有所不同,为了研究改造后的血红蛋白对血气分析是否产生干扰,Ali等使用了8种血气分析仪(AVLOmni6;AVOXimeters1000E,4000;CC270CO-Oximeter;ILSynthesis35;IL482andIL682CO-Oximeters;RadiometerOSM3Hemoximeter)对5种红细胞代用品(ApexPHP;DCLHb;Oxyglobin;rHb1.1;Hemolink)中MetHb含量进行检测。以上血气分析仪都是采用多波长分光光度计自动分析样品,波长数由4~128个不等。结果表明,对于同一种红细胞代用品而言,8种血气分析仪测定的MetHb含量变化幅度和标准差均较大,即不同仪器测定结果具有差别。影响测定结果的因素可能有两类:一类是血红蛋白结构、种属差异和外源性物质等改变了光学吸收,例如用PEG修饰Hb、用戊二醛或双阿司匹林进行Hb交联等。另一类是血红蛋白微囊、氟碳乳剂、颗粒和凝块等造成了光散射。2.3控制红细胞代用品中methb含量红细胞代用品具有许多优点,方便获得、成本低、避免输血传播疾病、不必进行交叉配型等。但是,红细胞代用品的安全问题需要谨慎对待。有文献报道,向体内输注PEG-Hb溶液,当PEG-MetHb含量>10%时,就会