灵芝多糖还原能力的研究

灵芝多糖还原能力的研究

在生物生命活动的氧化代谢过程中，会产生各种自由基。自由基不仅是生物体多种生理功能的启动因素和生化反应的介导者,同时也在免疫细胞因子网络中起调节、信号转导作用。现代生命科学、医学研究表明,随着年龄的增长,人类机体内自由基的自稳态平衡性下降,从而导致自身免疫功能下降,发生肿瘤、动脉粥样硬化、原发性高血压、Alzheimer型早老性痴呆等自由基疾病。灵芝(Ganodermalucidum)在我国自古就有“仙草”的美誉,已有悠久的药用和食用历史,《神农本草经》、《本草纲目》中都有灵芝的药效记载。多糖是灵芝中的主要活性组分之一。20世纪70年代以来,灵芝多糖的研究开发进入了一个崭新的发展时期,经过近30年的发展,人们对灵芝多糖这一重要生命物质产生了新的认识。据报道,从双孢蘑菇、灵芝、香菇、侧耳等6种真菌中提取出的活性成分,可以防止细胞内DNA的氧化损伤。刘志峰等研究证明,蘑菇提取物对脂质过氧化的抑制率可达29%。真菌提取物对自由基有一定的清除作用。真菌是自由基清除剂的良好载体。而多糖是真菌中的主要活性成分。目前,国内外基本上采用水浸法、碱浸法提取多糖,再经有机溶剂沉淀提纯。由于传统工艺采用碱浸、有机溶剂分离提纯等手段,易对灵芝多糖聚合体造成破坏,也易造成某些活性基团变性失活,且粗多糖提取效率极低。膜分离技术是近年来发展起来的在分子水平上实现机械分离的高新技术,由于其具有常温操作、无相态变化、高效节能、无污染等特点,且整个分离过程在密闭系统中进行,可避免和减轻热和氧对物料营养成分的破坏,因此,被认为是21世纪最有前途的技术。采用膜技术进行灵芝多糖的分离纯化,不仅收率高而且极少破坏灵芝多糖结构。作者在此对灵芝多糖的还原能力及其对羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(·O2-)的清除活性进行了研究探讨,并对不同工艺制取的灵芝多糖的清除自由基的能力进行了比较。1实验1.1材料、试剂和机器灵芝,天津市林业果树研究所。邻苯三酚、番红花T、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等,均为分析纯。恒温水浴箱,752型分光光度计。1.2提取灵芝河谷葡萄糖灵芝子实体→粉碎→粗滤→真空浓缩→醇沉→干燥(2)膜分离工艺灵芝子实体→粉碎→预煮→粗滤→微滤→超滤→浓缩干燥1.3性能试验1.3.1波长对研究内容的影响在2.5mLpH值6.6的磷酸缓冲溶液中加入1mL样品、2.5mL1%铁氰化钾,混合物在50℃恒温条件下加热20min,急速冷却,加2.5mL10%三氯乙酸,3000r·min-1离心分离,取上层清液2.5mL,加2.5mL水,再加0.5mL0.1%FeCl3,混合均匀,静置10min后在波长700nm下测吸光度A700。A700值越大,则样品的还原能力越强。1.3.2硫酸钠盐缓冲溶液体系中od值的测定·OH可使番红花T褪色,即在520nm处可测出·OH的生成情况,进而检测出加入样品的抗氧化活性。反应体系终体积4.5mL,其中含150mmol·L-1硫酸钠盐缓冲溶液(pH值7.4)、114μmol·L-1番红花T、1.927mmol·L-1EDTA·Na2、1.0mmol·L-1硫酸亚铁、3%H2O2以及不同浓度的样品,在37℃恒温水浴30min后,加入0.3mmol·L-1EDTA·Na2终止反应,以缓冲溶液作参比,在520nm处检测其OD值。空白组以0.1mL蒸馏水替代样品,对照组以1.5mL蒸馏水替代样品和EDTA·Na2。按式(1)计算清除率:1.3.3中间物生成量的测定根据吴慧平的方法,邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化生成有色中间物(在420nm处有最大吸收峰)和·O2-,·O2-对自氧化又起催化作用,依据有色中间物的生成量,可判断·O2-的生成量。实验体系为3mLTris-HCl缓冲溶液(pH值8.2)和0.1mL不同浓度的样品,25℃水浴20min后加入3mL浓度为7mmol·L-1的邻苯三酚,反应4min后加入10mol·L-1的HCl终止反应,以Tris-HCl缓冲溶液作参比,在420nm处测OD值。对照组以0.1mL蒸馏水替代样品,空白组为不加邻苯三酚。按式(2)计算清除率,根据清除率判断样品对·O2-生成的影响。2结果与讨论2.1还原能力的测定铁氰化钾还原法的原理为:在波长700nm条件下测定吸光度A700,结果见表1。由表1可知,0.10mg·mL-1灵芝多糖溶液的A700值与水体系A700值相当,说明该浓度(均指加入反应体系的样品起始浓度,下同)下灵芝多糖没有还原能力。随着浓度的增大,A700值也增大,多糖的还原能力在实验浓度范围内有较好的量效关系。以30μg·mL-1Vc溶液的还原能力作参比,1.00mg·mL-1多糖溶液的还原能力强于Vc。以相同起始样品浓度比较A700值,灵芝多糖还原能力明显低于Vc的还原能力,但灵芝多糖溶液还原能力的存在说明灵芝多糖具有抗氧化作用的可能性。2.2脂质过氧化法多糖可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧,减小脂质过氧化反应链的长度,阻断或减缓脂质过氧化的进行。对于·OH而言,可快速攫取多糖碳氢链上的氢原子结合成水,而多糖的碳原子上则留下一个成单电子,成为碳自由基,进一步氧化形成过氧自由基,最后分解成对机体无害的产物;对于·O2-,多糖可与其发生氧化反应,达到清除的目的。2.2.1羟自由基清除率由表2可知,随着灵芝多糖浓度的增加,对Fenton反应体系产生的羟自由基的清除率相应增大,且量效关系非常明显。在相同浓度下,膜分离工艺提取的灵芝多糖清除羟自由基的能力强于传统的水提醇沉工艺,IC50分别为1.36mg·mL-1、1.58mg·mL-1。2.2.2膜分离工艺提取的牛蒡多糖超氧阴离子自由基的能力由表3可知,随着灵芝多糖浓度的增加,对邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子自由基的清除率相应增大,且量效关系非常明显。在相同浓度下,膜分离工艺提取的灵芝多糖清除超氧阴离子自由基的能力强于传统的水提醇沉工艺,IC50分别为2.55mg·mL-1、2.83mg·mL-1。综上所述,膜分离工艺提取的灵芝多糖清除自由基的能力强于传统水提醇沉工艺。这是因为,在灵芝多糖的提取过程中,传统工艺采用了有机溶剂和多次高温处理,使多糖的生物活性受到影响。3不同工艺提取的岩溶多糖的抗氧化能力(1)灵芝多糖浓度在0.10mg·mL-1时,其A700值与水体系相当,没有还原能力;在1.00mg·mL-1时,多糖溶液的还原能力强于30μg·mL-1的Vc溶液;以相同起始样品浓度比较A700值,灵芝多糖还原能力明显低于Vc的还原能力。但灵芝多糖溶液还原能力的存在说明灵芝多糖具有