DNA体外重组技术

后续内容重组DNA技术（基因克隆）基因的体外表达与蛋白质的纯化癌基因与抑癌基因考试GeneCloningWhatdoesthetermcloningmean?Whatisgenecloning?Howdoesitdifferfromcloninganentireorganism?Whyisgenecloningdone?Howisgenecloningaccomplished?转基因植物照亮细胞的荧光蛋白脑神经网络（Brainbow）

在宣布获奖名单时，瑞典皇家科学院诺贝尔化学奖评审委员会主席贡纳尔·冯·海涅手持一支试管，内装用绿色荧光蛋白基因改造过的大肠杆菌。用紫外线照射后，试管发出绿色荧光。冯·海涅说，这种级别的发现“能让科学家的心跳比平时快上三倍”。美联社援引哈佛大学医学和放射医学副教授约翰·弗兰焦尼的话评价说：“这一技术彻底改变了医学研究。研究人员第一次能在活体细胞和活生生的动物身上同时研究基因与蛋白。”绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)Cloning-adefinitionFromtheGreek-klon,atwigClone:acollectionofmoleculesorcells,allidenticaltoanoriginalmoleculeorcell.Alsonamedasexualmultiplication.

指应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。重组DNA技术(RecombinantDNAtechnology)重组DNA技术操作过程可形象归纳为

重组DNA技术操作过程分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体1.分2.切3.接4.转5.筛基因克隆总体技术路线图第一节载体（vector）一、载体的分类按功能分：克隆型载体、表达型载体按受体细胞分：原核细胞载体真核细胞载体穿梭载体按载体来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体、粘粒载体Definition:allowingthe

exogenousDNAtobeinserted,stored,andmanipulatedmainlyatDNAlevel.载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker质粒载体pBR322复制起始点(ori)选择标记(amprtetr)单一的酶切位点“P”表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。（一）质粒载体质粒(plasmid)－是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。二、不同载体的特点和分类作为载体的质粒一般具有以下特点分子相对较小（3～10kb）；松驰型复制；具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；质粒能携带的外源DNA片段一般较小（<15kb）；作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。MCS－multiplecloningsite在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。genotype编码产物功能（phenotype）Ampr（氨苄青霉素抗性基因）β-内酰胺酶

水解β－内酰胺环，解除氨苄毒性Tetr（四环素抗性基因）1种膜蛋白可以阻止四环素进入细胞Camr（氯霉素抗性基因）乙酰转移酶生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使氯霉素失去毒性Neor（新霉素抗性基因）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活Hygr（潮霉素抗性基因）潮霉素β磷酸转移酶使潮霉素β失活几种常用的抗生素抗性基因（二）噬菌体载体线性双链DNA分子插入型载体/替代型载体用于构建基因组文库和cDNA文库λphage

溶菌阶段(复制和释放)

溶源阶段(整合到寄主染色体上)48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpλ重组体DNA分子的体外包装体外包装：把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒包装限制：λ噬菌体的包装能力，控制在野生型λDNA长度(48kb)的75%-105%包装上限51kb，必要基因28kb，故克隆上限为23kb.BacteriophagevectorsAdvantages:UsefulforcloninglargeDNAfragments

(10-23kb)InherentsizeselectionforlargeinsertsDisadvantages:Lesseasytohandle（三）人工染色体人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时柯斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人工染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。酵母人工染色体（YeastArtificialChromosomes,YAC）细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosomes,BAC）容量大！！！细菌人工染色体(BAC)细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间。各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（genecluster）结构构建动植物基因文库装载量范围:50-300kbBAC载体repE:控制F质粒复制parA、parB:控制拷贝数CmR:氯霉素抗性基因酵母人工染色体（YAC)

酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成。它可携带长达200-1000kb的DNA片段，因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。用酵母人工染色体克隆DNA的过程与λ噬菌体相似，将DNA大片段与载体的两臂相联，然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选。

正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel)*酵母自主复制序列（ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP1、URA3)YAC载体可携带长达200-1000kb的DNA片段BACsandYACsAdvantages:UsefulforcloningextremelylargeDNAfragments(100-2,000kb)ThisisveryimportantforgenomesequencingprojectsDisadvantages:NoteasytohandleextremelylargeDNAmolecules

质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体

DNA病毒载体,RNA病毒载体常用病毒载体:猴肾病毒SV40（SimianVirus40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等

目的：外源蛋白表达或研究其功能,基因治疗等。

（五）病毒载体逆转录病毒载体Whatdeterminesthechoiceofvector?insertsizevectorsizerestrictionsitescopynumbercloningefficiencyabilitytoscreenforinsertswhatdown-streamexperimentsdoyouplan?限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基团第二节基因工程中常用的工具酶（一）限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)限制性核酸内切酶--能识别并切割特定的核苷酸序列（回文序列）粘性末端平末端核酸内切酶的发现DanielNathans,WernerArber,andHamiltonSmith.NobelPrizeinMedicinein1978作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。前三个字母用斜体命名Hin

dⅢ

属种株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口(bluntend)粘端切口(stickyend)Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBg

lⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（二）DNA连接酶T4DNA连接酶连接反应最适温度12～20℃平末端连接温度可适当提高！T4DNAligase（三）DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow聚合酶－补平、标记探针、合成cDNA

、测序！！

3

5

外切活性、聚合活性TaqDNA聚合酶－PCR反转录酶－RT-PCR聚合活性、RNaseH

活性

（四）其它修饰酶碱性磷酸酶－切除5

端的磷酸基，防止自身环化末端脱氧核苷酸转移酶－寡核苷酸探针的末端标记第三节目的基因的获得目的基因（外源基因）cDNA/基因组DNA直接从染色体DNA中分离化学合成PCR或RT-PCR体外扩增目的基因从基因组文库中筛选向目的基因所有者或其所在的实验室索取*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列

化学合成法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备，采用DNA自动合成仪进行.

组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库(genomiclibrary)

存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库从基因组文库中钓mRNAcDNA

双链cDNA

重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制

从cDNA文库(cDNAlibrary)获取目的基因

是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）1985年由穆里斯（K.Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR：体外由引物介导的DNA酶促合成，也叫基因扩增变性退火延伸25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第四节目的基因和载体的连接粘端－粘端连接粘端－平端连接平端－平端连接其它连接方式人工接头T载体定向克隆粘端－平端连接定向克隆的概念

Theadditionofahomopolymertail(同聚物加尾）目的基因加接头载体加接头Artificiallinker（人工接头）第五节

重组DNA导入受体细胞受体菌的条件安全宿主菌遗传背景清楚！HB101；JM109；DH5a

处于感受态(Competentcells)即容易接受外源DNA的状态。特殊处理受体细胞

转化(Transformation):

是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。电击法CaCl2转化的主要方法导入方式

转化(transformation)：质粒为载体转染(transfection)：噬菌体和病毒为载体其原理是：细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形;转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面;经42℃短时间热击处理，可促进细胞吸收DNA复合物。

受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌CaCl2处理基因重组转染体外包装噬菌体噬菌体体外包装第六节重组DNA分子的鉴定基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。利用宿主细胞遗传表型的改变来筛选抗药性标志筛选插入失活β－半乳糖苷酶系统筛选分析重组子分子结构特性进行鉴定内切酶图谱鉴定Southern印迹杂交菌落原位杂交PCR鉴定测序1.抗药性标志的筛选如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetr

，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。

插入失活抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板DNA重组体与质粒自身环化的鉴别：插入失活法AmprTetsAmprTetrScreeningofthecloneThemediuminthispetridishcontainstheantibioticKanamycinThebacteriaontherightcontainKanr,aplasmidthatisresistanttoKanamycin,whiletheoneonthelefthasnoresistanceNotethedifferenceingrowthβ－半乳糖苷酶系统筛选

（蓝白斑筛选）

很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽；载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链；当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal

变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补；而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。

标志补救（α互补，ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H

片段COOH

片段X-galLacZ蓝色化合物X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷α互补的检测目录lacZBlue/Wh