我国微生物农药研究与产业化发展

我国微生物农药研究与产业化发展

中国微生物病虫害的防治和害虫防治研究始于20世纪50年代初至70年代末。20世纪80年代初，它取得了巨大的发展，尤其是在20世纪80年代中期。目前,我国在杀虫抗植病微生物资源的发掘、病原物与靶标生物之间相互作用规律的揭示、遗传工程技术与转基因杀虫抗植病遗传工程体的构建培育、微生物农药的应用和产业化等方面,皆取得了重大进展或突破。1寄生虫、抗生殖器微生物和寄生虫基因资源1.1芽孢杆菌的种类20世纪80年代以前,我国的杀虫细菌皆源自昆虫,此后从昆虫、土壤及仓尘中均有发现[5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29],且以土壤来源为主。发现的芽孢杆菌主要有苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus,Bs)、金龟子乳状病芽孢杆菌(B.popilliae)、侧芽孢杆菌(B.latersporus)、穿刺芽孢杆菌(B.penetrans)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)等10来种芽孢杆菌。无芽孢杆菌则主要有粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens)、荧光极毛杆菌(Pseudomonasfluorescens)、无色杆菌(Xenorhabdusluminescens)等。此外还报道了防植病的凝结芽孢杆菌(B.coagulaus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)及放射农杆菌(Agrobacteriaradiobacter)等。Bt菌资源的发掘研究受到高度重视,迄今我国已分离到8000株以上的Bt分离株,其中经不同程度鉴定和测试的Bt菌株在2000株以上。在全世界已知的70个H血清型的83个亚种中,我国发现了41个H血清型和无鞭毛型的菌株。鉴定了12个新亚种[2,15,16,17,18,19,20](表1)。获得一批Bt和其它芽孢杆菌的高毒力或特异性菌株[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29]。嗜线虫无色杆菌及其产生的杀虫毒素是一种值得注意的杀虫新资源。1.2年来我国报道的较重要虫生真菌生产情况全世界已报道的虫生真菌约800种,可寄生5个目100多属的215种昆虫。1980年以前我国发现和记录的虫生真菌种类仅30余种。20世纪80年代初以来大量虫生真菌和捕食与寄生线虫的真菌被发现和鉴定,至1996年已报道了405种虫生真菌,现已增加到430种[30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53],其中至少包括了30个新种。最有生产价值的是白僵菌属(Beauveria)和绿僵菌属(Metarrhizium)。20年来我国报道的较重要虫生真菌共25属的87个种[30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53]。90年代报道的虫生真菌中,绝大多数为寄生蚜虫为主的虫霉属(Entomophthora)、虫疫霉属(Erynia)及耳霉属(Conidiobolus),寄生蚧壳虫为主的镰刀菌属(Fusarium),寄生蚧和粉虱的座壳孢属(Aschersonia),以及寄生根结线虫的节丛孢属(Arthrobotrys)、单顶孢霉属(Monacrosporium)。仅在贵州柑桔害虫中就分离鉴定出13个属26个种的虫生真菌。1.3已报道的昆虫病毒到1982年我国发现了61种昆虫病毒,1995年增至190种234株,此后相继在各地主要是西南地区分离鉴定了一些种类,至今已报道的昆虫病毒近220种,约250株。表2列出了我国进入田间试验或应用的昆虫病毒。1.4抗植病药物及抗菌素我国自70年代初开始注意寻找杀虫和抗植病抗生素。井冈霉素(Jinggangmycin)的发现和开发是最成功的例子。80年代以来,发掘力度加大。现已发现的杀虫抗生素有,杀蚜素A、韶关霉素A1和A3(类似Piericidin)、南昌霉素A和B(分别类似Avermectin和Dianemycin)、梅岭霉素(类似Avermectin)、华光霉素(Nikkomycin)、浏阳霉素A、B及C(类似Tetranactin)、灭蚊链霉素(类似ActimycinA)及阿维霉素(Avermectin),对多个目的昆虫,特别是蚜虫、螨类、植病线虫、球虫等有效[62,63,64,65,66,67,68,69]。发现了多种抗植病的抗生素或活性物质[61,69,70,71,72,73,74,75,76],主要有井冈霉素、抗霉素120(类似AntimycinA)、公主岭霉素(Gongzhulingmycin)、波拉霉素、武夷菌素、中生霉素(糖苷类)、科生霉素、宁南霉素、多抗菌素等。这些抗生素对许多作物的病害,如水稻纹枯病、白叶枯病,瓜类花叶病、枯萎病,小麦赤霉病及果树的多种病害有控制作用。其中真菌来源的多糖蛋白性质的抗毒剂1号对几种植物花叶病、一种细菌素(Echin)对水稻白叶枯病等有效。几株链霉菌对杂草有一定防治效果。1.5osemalo权tae已报道了寄生于玉米螟、甜菜夜蛾、大猿叶虫、油桐尺蠖及家蚕的微孢子虫,1986年从美国引进了蝗虫微孢子虫(Nosemalocustae)。发现了寄生于粘虫、小菜蛾等鳞翅目及鞘翅目昆虫、蚊与绳、飞虱与叶蝉中的多种线虫,它们分别属于斯氏线虫属(Steinernema)、异小杆线虫属(Heterorhabditis)、罗索线虫属(Romenomermis)、多索线虫属(Agamermis)及卵索线虫属(Ovomeris)。1.6抗植病基因检测为构建遗传工程杀虫菌和转基因抗虫植物,我国自20世纪80年代中期以来已分离克隆了一批杀虫蛋白质基因,如来自Bt的ICP基因cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1B、cry1C、cry1E、cry1I(cryV)及cry2等[92,93,94,95,96,97,98,99],来自Bt和Bs的杀蚊基因,帮助蛋白基因p19、p20及p21等。已克隆了含cry3A基因的片段。报道了蝎毒基因AaIT、豇豆胰蛋白酶抑制因子CpTI基因、杆状病毒egt基因、白叶枯病菌致病基因hrp、抗马铃薯晚疫病的Osmotin基因、病毒增效因子序列、杆状病毒抗凋亡基因、几丁质酶基因。化学合成了抗植病的天蚕抗菌肽基因。探索了卫星RNA作为抗植病因子的可能性。以PCR技术从Bt菌中鉴定了大量cry1型、cry3型及cry2型杀虫基因。据报道,我国1996年研究开发中的杀虫基因共11种,抗植病基因48种,抗除草剂基因3种。本文提到的多数基因种类是此后发表的。至1998年全世界已发表了Bt的162种cry基因和14种cyt基因。杀虫基因的多样性表明了Bt的巨大潜力。2基础研究2.1icp快速鉴定对大量杀虫微生物的菌株进行了伴孢晶体超微结构、质粒分析、DNA的RAPD指纹鉴定、ICP与抗蛋白酶多肽及芽孢外层蛋白质成份分析等研究。在Bt菌株筛选和ICP快速鉴定中建立和应用了ICP快速简易的SDS方法。探索了蛋白质裂解气液色谱法用于Bt分类的可能性,在杀虫微生物及杀虫蛋白质基因的分类中应用了特异性引物PCR法和聚类分析方法。2.2昆虫致病性机制昆虫肠道蛋白酶对ICP的作用[133,134,135,136],病原微生物与毒素对昆虫的致病机制[127,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146]以及几种杀虫微生物产生的几丁质酶的研究取得进展。证明了玉米螟血细胞表面凝集素受体可与糖基类物质特异结合。2.3对icp基因表达的影响国外早先的研究已证明类似分子伴侣的小分子量蛋白质对ICP的形成有促进作用。国内先后报道了Bt的帮助蛋白p19、p20等对ICP基因的表达有促进作用,即促进ICP正确构型和伴孢晶体的形成,是一种分子水平上的增效作用。杆状病毒的增效序列也可提高昆虫病毒的致病力。在活体外,Bt发酵上清液中的增效物质和Zw-A对Bt有显著增效作用。而活性氧则损伤伴孢晶体。2.4抗抗日战争昆虫对杀虫微生物的抗性备受关注,但只有少数有关小菜蛾对Bt产生抗性的室内试验结果。在使用Bt较多的广东则报道田间出现抗性。2.5黄地老虎gv、传统型基因的基因组织1997年国内外报道了近60个杆状病毒基因。我国定位或克隆的杆状病毒基因或序列主要有油桐尺蠖NPV、棉铃虫NPV、粘虫NPV及黄地老虎GV的多角体和颗粒体蛋白基因[156,157,158,159,160],杆状病毒的抗细胞凋亡基因,egt基因,DNA聚合酶基因,几丁质酶基因,衣壳主蛋白基因,增效因子序列及早期基因启动子等。我国已与美国科学家合作分析黄地老虎GV的基因组全序列,有望解读其基因组的全部基因。2.6bt与-外毒素的关系我国Bt菌的自然生态分布研究表明,在南、北、西三大区块中,优势H血清型有所差异[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。证明在果园中使用Bt杀虫剂后Bt在环境中有定居的迹象,但无流行病的证据。β-外毒素在水体和植物上半衰期长达433小时,故应避免使用产β-外毒素的菌株生产。有关专家认为虫霉目(Entomophthorales)真菌能形成大规模昆虫流行病,但因其分生孢子易多次萌发,难以发酵生产,人工应用价值不大。3遗传改良和寄生虫聚集3.1枯草芽孢杆菌与bt基因型菌株的融合菌培养进行了种间和种内的原生质体融合,但所得融合子难以同时高效表达亲本双方的杀虫基因。枯草芽孢杆菌B-908与Bt的原生质体融合菌兼有杀稻纵卷叶螟和抗纹枯病的效果。原生质体融合放线菌可提高武夷毒素的效价。3.2重组菌毒力检测将基因cry1Ac和p20转入野生Bt菌和基因cry1C转入野生Bt菌中,重组菌对小菜蛾、棉铃虫或甜菜夜蛾毒力提高1-3倍。将含cry1Ac的重组质粒转入含cry3A的杀鞘翅目Bt菌,获得了双基因高效表达的广谱Bt重组菌,并已完成中试。3.3y1a基因突变将携带cry1Aa和p20的重组质粒转入球形芽孢杆菌中,表达了杀蚊双元毒素和Cry1Aa毒素。杀蚊130KD基因或cry1A基因转入枯草芽孢杆菌,获得杀蚊和杀虫并抗水稻纹枯病重组菌。cry基因转入荧光假单胞菌获得杀虫和抗小麦全蚀病重组菌。球形芽孢杆菌杀蚊基因转入固氮蓝藻(Anabaenasp.)获得了固氮杀蚊工程藻。3.4光假单胞菌以转座子突变法获得了抗小麦全蚀病的荧光假单胞菌。使水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzae的致病基因缺失,缺失基因重组菌抗水稻白叶枯病。3.5虫细胞表达Bt的cry1A基因在杆状病毒中克隆,并在昆虫细胞中表达。egt基因缺失重组棉铃虫NPV于1989年获准进入田间释放,而egt缺失和带蝎毒基因的双重重组棉铃虫NPV已获准进入中试。4物农药种类我国微生物防治的对象,20世纪80年代以杀虫为主,90年代扩大至杀虫、防植病及杂草。微生物农药种类由Bt、白僵菌杀虫剂为主,扩大至昆虫杆状病毒、杀虫抗生素、抗植病抗生素、昆虫寄生线虫等。90年代中期,全国作物病虫害发生面积为34.53亿～44.0亿亩(次),其中以微生物防治为主的面积约3.5亿亩(次),约占农作物病虫害发生总面积的8.0～10.0%。4.1防治水产害虫Bt杀虫剂是我国的主要推广微生物农药。80年代中开始,大量用于棉花、蔬菜害虫的防治,少部用于防治水稻、果树及林业害虫,防治对象主要为棉铃虫、小菜蛾及松毛虫等,取得了良好的防治效果与生态效益。1999年研制成功杀鞘翅目YM-03Bt杀虫剂,对马铃薯甲虫等有良好防效。对甜菜夜蛾有较好防效的Bt杀虫剂也在研制中。Bt防治面积1990年为1500万亩,至1995年增至约1.5亿亩。4.2氏白噬菌制剂球孢白僵菌(Beauveriabassiana)杀虫剂主要用于防治松毛虫和玉米螟。近几年正在开发布氏白僵菌(B.brongniartii)杀虫剂,以防治地下害虫蛴螬。据不完全统计,白僵菌杀虫剂防治面积1995年在1000万亩以上,近年应用面积稍有增加。由于聚合凝胶的研制成功,增加了持效性和防治效果。4.3蛛克菌阿维菌素(Avermectin)是90年代初发展的一种杀虫、螨及动物寄生虫的高效广谱杀虫剂。我国阿维菌素的商品剂—虫螨克,在1996至1997年全国26个省、市、自治区防治蔬菜示范及推广应用中,对小菜蛾、甜菜夜蛾、螨、蚜有80—98%的防效,对美洲斑潜蝇防效为60—99.1%,1997年推广面积为13.6万hm2(近200万亩)。我国分离鉴定和开发的南昌霉素和浏阳霉素也有商业产品,前者对昆虫、螨类、植病线虫、球虫等有效,后者对螨类效果良好,但二者应用面积较小。4.4农抗1263水稻纹枯病井冈霉素是一种对水稻纹枯病有良好防治作用的抗植病抗生素,在80年代中期实现了工业化生产,并推广使用。90年代中期年产量3万—4万吨,可供防治1.5—2亿亩水稻纹枯病,每亩只需3—5克就可收到满意效果。至今尚未发现纹枯病对它的抗药性。农抗120是一种含Antimycin类抗生素的放线菌剂,在较大面积应用,防治作物的多种真菌病害。波拉霉素、华光霉素、武夷霉素等抗植病抗生素也进入了田间试验。4.5和乳悬剂的应用棉铃虫杆状病毒杀虫剂是我国第一个商品化生产的病毒杀虫剂,粉剂和乳悬剂都已推广应用于棉铃虫的防治。斜纹夜蛾NPV杀虫剂—虫瘟一号、黄地老虎GV杀虫剂及菜青虫GV杀虫剂等5种昆虫病毒杀虫剂均已注册,并有一定应用面积。增效重组病毒复合杀虫剂即将投入生产。4.6防治害虫方法斯氏线虫Steinernemafeltiae等已在田间用于防治小菜蛾、桃小食心虫、地老虎、蝇蛆、天牛等害虫。异小杆线虫HeterorhabditisSp.泰山1号已中试生产,防治大蜡螟等效果良好。4.7抗菌类化合物part转基因cry1Ac与p20高效重组Bt菌对棉铃虫、小菜蛾毒力增强。含基因cry1Ac和cry3A的广谱重组Bt菌Lcj-12等对棉铃虫等鳞翅目害虫和马铃薯甲虫等鞘翅目害虫的杀虫效果良好。人工突变型荧光假单胞菌和转cry1A基因的重组假单胞菌在田间表现了抗小麦全蚀病或抗病杀虫效果。egt基因缺失重组棉铃虫杆状病毒和转蝎毒基因AaIT并egt缺失的双重重组杆状病毒毒力提高,致病速度加快。以上均获农业部农业生物基因工程安全性评价批准,进入中试或野外释放。5商品化、产业化。在实行大学生化我国微生物农药的产业化始于20世纪60年代中期Bt的工业化生产,继而由商品化到目前的多品种的产业化,至今已有35年。经济发展的需求和国家三个五年科技攻关计划的完成,促进了我国微生物农药大吨位、大市场、高技术、高质量的产业化局面的形成。5.1抗植病药物及昆虫病毒制剂我国目前已登记的和进行商品化生产的微生物农药中,Bt杀虫剂4个品种,白僵菌杀虫剂1种,杀虫抗生素有阿维菌素、浏阳霉素、南昌霉素、华光霉素(兼抗植病)等;抗植病抗生素有井冈霉素、农抗120、宁南霉素等;昆虫病毒杀虫剂有棉铃虫NPV、斜纹夜蛾NPV、黄地老虎GV及菜粉蝶GV(及其与Bt的复合剂)等。但达到产业化规格和规模的则只有4种,其中Bt杀虫剂和井冈霉素是产量最大的两种微生物农药,白僵菌杀虫剂正在完善生产技术和质量标准化,行业标准即将公布,接近产业化水平。据资料(辛德辛,1999),我国农药年产量约35万吨,加工制剂约100万吨。目前我国生物农药年总产量75000吨左右,约占总农药的7.5%。有关情况列于表3。5.2bt药剂产品在Bt生产中,利用变温发酵有效地控制了噬菌体的危害,倒罐率降至0.7%。各种助剂对Bt晶体蛋白质毒素、芽孢、毒力的影响的系统研究结果,为Bt乳悬剂的有效贮存期提供了可靠依据。标准化毒力测定技术研究是我国颁布的Bt杀虫剂行业标准的基础。高效杀鞘翅目Bt杀虫剂研制成功,增加了我国Bt杀虫剂的新品种,菌泥制条结合烘道热风干燥的简易后处理工艺,粉剂毒力效价可达10000IU/mg以上。我国Bt杀虫剂年产量在1995年已达30000吨左右。大型生产厂家3-4家。发酵效价可达3000IU/微升,乳悬剂有2000IU/微升和4000IU/微升及8000IU/微升三种,可湿性粉剂有8000IU/mg和16000IU/mg及32000IU/mg三种规格。白僵菌液固两相一体化生产新工艺的建立缩短了发酵时间,并将产品分生孢子含量提高至1000×108/克,回收率达88%。白僵菌杀虫剂(粉剂)1992年全国年产量约2300吨。产品有含孢子量50亿/克、100亿/克二种,高含量产品可达500亿～1000亿/克。利用诱变高产菌株生产阿维菌素,发酵单位可达3500—4000ug/ml。5.3抗植病药物的使用目前我国的Bt杀虫剂的剂型以水悬剂(SC)为主,