银胶菊花组织对稗草的化感作用及其活性物质成分研究

银胶菊花组织对稗草的化感作用及其活性物质成分研究

化感作用是指植物或微生物通过环境中释放某些特定的化学物质，并对其他植物或微生物产生直接或间接的影响。该功能在自然生态系统和农业生态系统中发挥着重要作用。银胶菊PartheniumhysterophorusL.为菊科银胶菊属草本植物,在我国,于20世纪50年代首次被发现,广西省2007年调查结果表明,其已侵入耕地,影响作物产量。银胶菊适应能力强、繁殖快、危害大、极难防除。Kohli等研究证实,银胶菊有较强的化感潜力,可减少入侵区域的生物多样性,抑制临近杂草和作物生长;Megharaj等和Tefera研究发现,银胶菊的叶具有较强的化感作用,可抑制小球藻、苔麸等多种生物的生长;Pandey等则发现,银胶菊花水浸提液对水葫芦的化感抑制作用略高于叶水浸提液;陈业兵等研究发现,银胶菊叶水浸提液可抑制苘麻和稗的生长。实地调查发现,稗草生长密集的区域,在银胶菊侵入并逐渐成为优势种群后,稗草无论是在数量还是生物量上都明显下降,且银胶菊花期长、花量大。目前对银胶菊花的化感作用研究较少,特别是对花所释放的化感物质尚未见详细报道。作者以稗草作为受体植物,研究了银胶菊花的化感作用,并就其化感活性成分进行了分离和鉴定。1材料和方法1.1仪器、试剂和仪器银胶菊花采自山东省临沂市莒南县,在盛花期采集,常温下阴干。受体植物稗草Echinochloacrusgalli(L.)Beauv.种子,采自山东省泰安市郊区。GC-MSQP2010Plus气相色谱-质谱联用仪、UV-2201型紫外分光光度计,日本岛津公司;中压液相制备色谱仪、旋转蒸发仪R-210,瑞士步琦公司。乙酸乙酯,分析纯,天津市永大化学试剂开发中心;正丁醇,分析纯,天津市盛奥化学试剂有限公司;三氯甲烷,分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司;甲醇,色谱纯,天津市凯通化学试剂有限公司;石油醚,分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司;丙酮,分析纯,中国·天津市巴斯夫化工有限公司;丙酮,色谱纯,天津市凯通化学试剂有限公司。1.2ue5e81.3不同萃取物溶液的制备参照陈业兵等方法,将150ue5e8g花放入2.5ue5e8L的广口玻璃瓶中,加入10倍量的蒸馏水,常温下浸泡48ue5e8h,浸提液经抽滤后,得母液,浓度记为100ue5e8g/L,4ue5e8℃冷藏待用。取200ue5e8mL母液,分别用乙酸乙酯和正丁醇按母液ue5e8∶溶剂=1ue5e8∶1(vue5e8∶v)萃取3次,将同一种溶剂的3次萃取液合并,在旋转蒸发仪上浓缩蒸干得2种溶剂萃取物和剩余水相物质,所得物质用蒸馏水定容至400ue5e8mL(等同于50ue5e8g/L水提液中所含有的各相物质浓度),以蒸馏水为对照,并于4ue5e8℃冷藏备用。另取400ue5e8mL母液,先后用乙酸乙酯和正丁醇按1ue5e8∶1萃取3次,合并萃取液,分别浓缩蒸干,得3种溶剂萃取物。将3种萃取物干物质(0.1ue5e8g)分别用0.25ue5e8mL丙酮助溶,然后用蒸馏水定容至1ue5e8g/L,密封,并于4ue5e8℃冷藏备用。以加入相应比例丙酮的蒸馏水为对照。1.3生物活性试验1.3.1干枝的催芽作用参照刘迎等方法,在直径9ue5e8cm的培养皿内垫2层滤纸,加入6ue5e8mL上述配制的处理液,将经催芽的稗草(10粒)播入培养皿内,以蒸馏水浸湿的培养皿为对照,每处理重复3次。将培养皿置入培养箱内,28ue5e8℃下暗培养,3天后调查稗草根长、芽长、鲜重。1.3.2种子处理和活性研究参照陈绍莉等土壤盆栽法测定银胶菊花对稗草生长的影响。在12ue5e8cm×10ue5e8cm(上口直径×高)塑料盆中装入600ue5e8g土壤(用100ue5e8mL浓度为50ue5e8g/L的银胶菊花水浸提液的3种不同极性组分浸湿),然后将稗草种子25粒播入土壤中,以去离子水浸湿的土壤为对照,每处理重复4次。处理后置于可控日光温室内,温度20~35ue5e8℃,光照11ue5e8500~24000lx,L/D=14ue5e8h/10ue5e8h,相对湿度70%~90%。发芽后,每隔1天向塑料盆中补充适量水分,每隔10天向相应的塑料盆中加入80ue5e8mL浓度为50ue5e8g/L的处理液。稗草播种10天后记录各塑料盆种子的发芽数,每盆定株5株稗草。稗草播种45天后取样,记录苗高和鲜重,计算抑制率。抑制率(%)=[1-处理苗高(鲜重、种子萌发数)/对照苗高(鲜重、种子萌发数)]×1001.4gc-msqp分析对生物活性强的乙酸乙酯相进行硅胶柱层析分离。利用中压液相制备色谱,采用干法装柱,以乙酸乙酯洗脱,各收集流分以薄板层析(TLC)跟踪检测,合并相同的流分,减压浓缩后得11个组分,记为1~11号,对11个组分进行活性测定发现3号的生物活性较强。对3号继续进行层析分离,以三氯甲烷//甲醇、石油醚//丙酮(分析纯)等多次洗脱,经薄板层析(TLC)跟踪检测,并辅以紫外分光光度计光谱扫描,得到较纯的4个主要组分A1、A2、A3、A4。利用GC-MSQP2010气相色谱-质谱联用仪分析样品的物质成分。用丙酮(色谱纯)稀释所得的样品,然后在气相色谱-质谱联用仪上进行化学成分分析。色谱条件:色谱柱为Stabilwax-DA30ue5e8m×0.25ue5e8mm×0.32ue5e8μm石英毛细管柱,起始温度为50ue5e8℃,保持2ue5e8min,然后以8ue5e8℃/min升温至230ue5e8℃,恒温5ue5e8min。载气为氦气,纯度≥99.99%;EI离子源,电子能量为70ue5e8eV;扫描范围为45~450质谱质量单位。样品经气质联用分析后,对总离子流图中的各峰进行质谱扫描后得到质谱图,经NIST、WILEY质谱数据库进行计算机检索,人工谱图解析,按各色谱峰的质谱裂片图与文献核对,查对有关质谱资料,将基峰、质荷比和相对丰度等与标准谱图进行对照,鉴定其中的化学成分。1.5数据计数所有数据用DPS软件中的Duncan氏法进行方差分析和差异显著性检验。2结果与分析2.1正丁醇相对采用幼苗生长促进化感效应的试验结果浓度为50ue5e8g/L的乙酸乙酯相抑制稗幼苗生长的强度最高,对稗根长、芽长、鲜重的抑制率分别为73.0%、43.0%、31.9%;正丁醇相对稗幼苗生长呈现促进和抑制两种化感效应;而剩余水相对稗幼苗生长呈现促进作用(表1)。2.2不同品种、不同干重的抑制率浓度为1ue5e8g/L的乙酸乙酯相对稗幼苗生长的抑制强度也最高,与其它处理相比,差异达显著水平,对稗根长、芽长、鲜重的抑制率分别为54.8%、26.1%和24.3%;而浓度为2.5ue5e8g/L的丙酮水溶液对稗根长、芽长、鲜重的抑制率分别为3.7%、-1.5%和2.3%(表2)。2.3正丁醇相对有良品对幼草生长的影响结果显示,在50ue5e8g/L处理浓度下,乙酸乙酯相对稗草萌发和幼苗株高、鲜重的抑制强度最高,抑制率分别为11.1%、10.2%和14.6%;正丁醇相对稗草萌发和幼苗生长呈现促进作用;而剩余水相虽然抑制稗草萌发,但却促进其幼苗生长(表3)。2.4化学成分分析采用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析乙酸乙酯相中较纯组分的化学成分,合并各组分中相同的化学成分,结果发现,乙酸乙酯相较纯组分中含有15种主要化学成分,分别为癸烷、1,3,5-环庚三烯、甘菊环烃、1,4-二氢-1,4-亚甲基萘、2,3-二甲基-3-丁烯-2-醇、3-(3,3-二甲基环氧乙烷-2-基)-2,2-二甲基丙酸乙酯、1-[1-甲基-1-(戊氧基)乙氧基]戊烷、苯、甲苯、4-甲基-3-戊烯-2-酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮、1-甲基萘、苯甲醇、联苯和甲氧基乙酸(表4)。3乙酸乙酯相的化感活性化感物质是经自然途径进入环境的化学物质,在自然状态下,除水以外,没有其它溶剂能将植物地上部组织中的化学物质淋溶出来。银胶菊花水浸提液虽经不同溶剂萃取,但萃取成分均来源于水浸提液中的水溶物质,所以本试验中抑制稗草生长均是银胶菊花水浸提液中水溶物质所致。本试验利用定性测定方法,测定了银胶菊花水浸提液的3种不同极性组分的抑制强度,同时,为了明确3种不同极性组分间的生物活性大小,采用了同等浓度干物质处理的定量测定方法,这与以往研究化感的方法有所不同。室内培养皿法和温室盆栽法研究结果表明,银胶菊的花水浸提液的3种不同极性组分中,乙酸乙酯相显示出较强的化感抑制活性。采用GC/MS技术,对乙酸乙酯相化学成分进行分析,发现乙酸乙酯相中含有的化合物种类十分复杂,主要为烃类及其衍生物、烯类、萘类、醇类、苯类、酸类、酮类和酯类物质,并对其15种主要化感物质进行了结构鉴定。其中,癸烷、1,4-二氢-1,4-亚甲基萘、2,3-二甲基-3-丁烯-2-醇、1-[1-甲基-1-(戊氧基)乙氧基]戊烷、苯、甲苯、1-甲基萘、苯甲醇、联苯等9种物质的除草活性已有报道;1,3,5-环庚三烯、甘菊环烃、甲氧基乙酸、4-甲基-3-戊烯-2-酮和4-羟基-4-甲基-2-戊酮等5种物质也有药用或营养成分方面的报道;而3-(3,3-二甲基环氧乙烷-2-基)-2,2