HPLC方法建立经验

我的研究课题是从发酵液中提取一种小分子抗生素，并得到其纯品。在这个过程中，想用高效液相色谱帮助指导别离，最终开发出用于测定发酵液效价的方法。要到达这个目的，首先要找到一种适宜的分析方法，可以将目标组分与其它杂质分开，并优化到适宜的保存时间和良好的峰型。这其中有一个很大的困难：没有目标组分的纯品，不了解其结构。在这种情况下，如何选着色谱柱？如何配比流动相？这一切都是摆在我这个新手面前的挑战。希望此贴能给像我一样刚开始接触HPLC的战友一些经验。

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我的目标成分〔发酵液中的活性成分〕是一种小分子抗生素，到目前为止对它有以下了解：

1.这是一种小分子物质

2.这种物质极性很强，不溶于绝大多数有机溶剂

3.这种物质在酸性条件下带正电荷，可能呈碱性

在进行高效液相分析之前，发酵液已经经过了预处理，并用大孔树脂、离子交换树脂等在生物显影的指导下进行了初步的别离纯化〔事实上到这可能很多朋友都看出来了，这种物质在发酵液里，说明它溶于水的。可以用离子交换，就是能电离，那么一定极性不低。如果是行家，可能就不会像我傻乎乎的还用C18+甲醇水摸半个月条件了^-^〕。用于上样的样品组成应该不是特别复杂，推测只有一个活性成分，另外活性成分和杂质应该极性都较强。

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1.某品牌C18柱，5μm，4.6×200mm

2.极限C18-AQ，5μm，4.6×250mm〔Ultimate柱试用体验〕

Agilent1100series，在线脱气机，手动进样器VWD检测器

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我主修的专业和仪器分析相去甚远，也没有接触过HPLC，这次要完成这个任务，起初还是很盲目的。我们实验室有安捷伦1100高效液相色谱仪，配备手动进样器和VWD检测器。第一天站到这台机器面前，简直不知道从哪下手，哪个局部是干什么的也不清楚。于是就找到了当地的安捷伦销售〔很幸运这销售是我校友〕，去图书馆借书，查资料，打安捷伦客服〔这个客服真管用，态度好，讲解细，建议大家多打〕，请学校老师帮助，总算是初步上手了。学会使用色谱仪后，就遇到了第一个问题，选择适宜的色谱柱。

如何针对我这个样品选色谱柱呢？说实话，当初看到品牌众多，编号各异的色谱柱时都蒙了，让我自己选是不可能了，于是找到了老师和卖色谱柱的工程师。打听了一大圈之后最终得到的建议是用一根C18柱〔现在看这可能也是在蒙，是一种通用的做法，因为大局部的分析都是在C18上完成的〕，于是就买了某品牌C18色谱柱一根，装到色谱仪上，满心欢喜之时，遇到了第二个问题，选择流动相。

说来惭愧，开始连流动相的概念和有机溶剂〔比方乙腈〕的概念都分不清。也是到处打听，最后买了乙腈和甲醇，选择了最常用的流动相：有机溶剂-水体系。

这些都有了之后，便开始了尝试。如果要用一个词来总结这些尝试，那就是：失败。有强吸收的地方大多在死体积里。最后甚至用了纯水作为流动相〔洗脱能力最弱〕，依然不能得到很好的效果，愁啊。

下列图是用纯水做流动相得到的色谱图

乍一看图可能还是可以的，但比拟分析之后发现我的目标组分应该是那个2.4分钟左右出峰的。对于一根200mm的柱子来说，这段可能处于死体积的边缘，干扰很多，对以后的定性定量都不利。所以彻底放弃了这种最常规简单的有机溶剂水体系，开始寻求别的方法。

另外想说说很多讲HPLC的书里带的方法开发流程图。因为我刚开始学习HPLC，见到书上的这个流程图时如获至宝，但是仔细一看却心灰意冷。对于一种未知物质，很难用这个图来开发。首先一个分子量大小就得我猜半天，然后是极性还是酸碱，都很难判断。更何况让一个没有经验的人看，这图本身就很难理解。所以我觉得对于新手，又是未知物质，还是先咨询下有经验的人，然后踏踏实实的慢慢开发，在这个过程中就会增长自己对HPLC的理解，找到适宜的方法。〔再想想如果是物质，那可能都有现成的方法，多查查文献就好了〕。总之个人觉得那个图可能对于有经验的人更有意义。

某日在仪器信息网上闲逛，看到了月旭的这个试用活动，于是填写了申请表，想碰碰运气。结果下午就接到了月旭工程师的。在了解了我的样品情况和已经做过的试验之后，月旭工程师给出了这样的建议：1，用不同pH的磷酸盐缓冲液作为流动相；2，不同pH的磷酸盐缓冲液中应用离子对试剂〔辛烷磺酸钠〕；3，换色谱柱，使用月旭公司的AQ柱。整个过程中，月旭工程师的专业知识和良好的态度给我留下深刻印象。第二天，我收到了月旭公司从上海寄过来的色谱柱〔真快！〕，定了药品，准备新的尝试。

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六.同样流动相，两个色谱柱的比拟

所有的药品都到齐了之后，配好流动相，我首先在相同流动相的前提下，对两个色谱柱的别离效果进行了比拟。结果说明，月旭AQ柱无论在峰型和保存时间上都远好于另一只色谱柱〔这里我们认为色谱图中最显著且主要的峰是我要的有效成分，为什么？以为我做了不同别离程度的样品，结果不变的都是这个峰，嘿嘿〕。当然，这并不是在比拟两个品牌的好坏，因为一个是普通C18，一个是C18AQ。但是这个比拟证明了AQ柱更适合分析我的样品,也就是说AQ柱更适合强极性的样品。下列图是某品牌C18柱色谱图接下来是UltimateC18-AQ

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七.确定色谱柱，进行流动相的优化

从上面两柱比拟的图可以看到，UltimateC18-AQ表现良好，特别是在离子对试剂纯在的条件下，分得更开且峰型更好。但是有一个缺点：保存时间太长。所以就要加一些有机溶剂进去，增加洗脱能力，减少保存时间。在月旭工程师的帮助下我选择了乙腈。在上述离子对流动相里添加了10%的乙腈后，保存时间显著缩短，且峰型依然很好。这样最终确定了用于别离的的流动相组成。

下列图是参加了乙腈，最终确定的流动相跑出的色谱图

这里有一些小细节。上图中的2，3事实上是同样的流动相〔开始我是这么认为的〕，2是事先把乙腈按比例加到水相里，然后调好pH。3是先调好pH，然后用四元泵将乙腈和水相混合。可以看出3是有明显拖尾的，后来我测了pH才发现3的pH升高了许多。也就是说如果流动相里要参加有机溶剂，特别是在对pH要求较高的时候，不能用四元泵将二者混合，而要事先混合，调好pH,脱气，用泵的一个通道进去。

还有图中的1，这是将2中的pH降低了0.3后得到的色谱图。由图可以看出，。在使用离子对的时候，pH的变化会显得非常敏感。。在这里我将pH优化到2.2，峰的对称性几乎等于1.

在上面确定了很好的别离条件之后，有一个问题是必须考虑的：那个看似完美的峰是不是个纯物质形成的呢？要答复这个峰纯度问题，我查到了两种现有条件可行的做法。第一，使用DAD检测器，得到三维的光谱色谱图，利用工作站附带的检验功能检测峰纯度。第二，液质联用，检验峰纯度。对于第一种方法呢，我也没有DAD检测器，而且这种方法也不是很可靠，所以暂时没有考虑。于是决定采用可靠的LC-MS。

这里又碰到一个问题，要想上MS，就不能用离子对把流动相搞得如此复杂。想来想去，又把打到月旭工程师那了〔真不知道是我在做实验还是月旭工程师在做实验，谁让我是新手呢，呵呵〕，得到了一个方法。上边比拟的图中可以看到，TFA的别离效果也是可以的，如果能确定TFA中的主要峰和离子对中的主要峰是同一个，那么用TFA做液质联用就没问题了。接下来就将我们的分析型液相当半制备用，用来收集和检测，我的做法是这样的：

〔1〕用离子对试剂的流动相进行别离，估计好时间在管路的出口处收集目标峰

〔2〕将收集到的馏分用离子对试剂流动相进行检验

〔3〕吹干得到的馏分，溶于TFA流动相，用TFA流动相进行检测

经过了上面三步，又出现了新的问题：

1.第二张图里，主峰前面还有一些杂峰，如果从我收集的局部来讲，是不可能收集到那的。那为什么会有呢？我猜想原因可能是这样的：我收集了大约3ml馏分，然后用吹风机一顿吹，吹成了几乎干了。〔为什么不吹干？因为我怕吹跑了，哈哈〕后来又把它溶到0.2mlTFA流动相中，这样事实上里面成分和浓度是有变化的，所以可能产生了一些莫名其妙的峰，因为这并不是很关键，峰值也不高，也没有太在意，如果那位战友有别的见解，请指教！2.明明是在离子对中的一个峰，到TFA里怎么就变成两个了？这个问题可是很头疼的啊，分析其原因，可能有以下两个：第一，在离子对中的单一峰是假象，事实上就不是一种物质，而是至少两种物质，只不过离子对流动相没有分开，而到TFA流动相中就分开了〔在这里不得不提一个问题，就是本底，或者说背景，这也是月旭工程师提醒我的。相对TFA，离子对可以抬高本底。也就是说有些物质虽然在离子对没有峰，但它确实存在，而是被离子对的高本底盖过去了，但是到TFA时本底一降，也就表现出来了〕。第二，上面说过了，从3ml的离子对流动相浓缩成0.2ml，事实上浓缩了15倍，在这个过程中辛烷磺酸钠的浓度也极大的提高了。而辛烷磺酸钠在210nm是会有一定吸收的，所以可能有一个峰就是辛烷磺酸钠。〔到这了可能有网友问我，那有没有用TFA流动相跑一个离子对流动相的样品呢？答案是有。我吸取了20微升离子对流动相，然后在TFA流动相条件下跑，结果除了一开始的杂峰之外是没有别的峰的，如下列图。但是这个“空白对照〞可靠吗？事实上也不可靠，因为他的浓度比拟低，所以我疑心它作为对照的可靠性。〕

考虑了这两个问题之后呢，我又进行了一个实验。把我的样品用TFA流动相也跑一下，看看是几个峰。〔到这不知道是不是有人有点对我的样品糊涂了啊，呵呵。我做以上所有的实验都是用的同样样品，假定他是A，然后把A用离子对流动相别离，收集了目标馏分，然后浓缩，再溶于TFA流动相，现在称它为称为a。所以到现在有两个样品两种流动相〕就是A用TFA流动相跑，这个在上面有图的。好了，下面让我们看看这张冲动人心的图吧〔下列图所有样都是TFA流动相〕。

从上图可以看出，我的样品〔即A〕在TFA流动相中相应位置是只有一个峰的，a样品是从A样品来的，但是它在相应位置有两个峰的可能性是不大的，据此推测a样品中出现的那个峰有可能是辛烷磺酸钠。另外图中还有两个“空白对照〞，虽然他们没峰，但是因为浓度远远不同，所以我觉得不太可靠。这样呢，上面第二个问题有了一个比拟可能的答案了，即多出的一个峰是离子对造成的。〔还有从上图看出同样样品的重复性很差，不知道为什么。咨询了工程师，说可能是因为强保存物质造成的，所以就反冲了柱子，不知道能不能解决。〕

接下来希望能验证一下这个想法，还想做以下实验：

1.用TFA流动相来跑一下相应浓度的辛烷磺酸钠，来个真正的空白对照。

2.用TFA别离A，然后用离子对流动相分析收集的馏分。

上面实验说明了在验证峰纯度的过程中出现的问题。对于上面的两个峰提出了假设的解释，并设计了新的实验。现在按照前面的设计，这两个实验都做完了，结果是这样的：

1.用TFA流动相来跑一下相应浓度的辛烷磺酸钠，来个真正的空白对照。

我这次把离子对流动相3ml吹成了200ul，即浓缩了15倍。经过TFA流动相检测发现，并没有峰出现。也就是说，前面推测“新出现的峰是由于收集馏分中残留的离子对造成的〞是错误的，残留的离子对试剂在TFA流动相中不会出现明显的峰。这样的结果导致上面两个峰的