紫茎泽兰对马铃薯晚疫病菌的抑菌机制研究

紫茎泽兰对马铃薯晚疫病菌的抑菌机制研究

晚疫情是由流行病引起的毁灭性疾病。马铃薯晚疫病的发生和流行每年给世界粮食生产造成的损失达170亿美元,中国的损失约为10亿美元。培育和推广抗病品种是防治马铃薯晚疫病的基本措施,但目前防治该病仍主要依靠施用化学农药,由此造成了环境污染、抗药性菌株产生、农药残留等一系列问题。植物源生物农药在自然环境中具有降解快的特点,使用过后不易导致环境的污染和抗药性菌株的产生。紫茎泽兰(EupatoriumadenophorumSpreng)属于菊科泽兰属植物,在20世纪40年代由国外传入云南西部及南部边远地区,因其大量蔓延,对农、林、牧业生产造成严重危害。云南农业因紫茎泽兰草害引起的损失每年达7亿多元。近年来,科研人员开展了对该草的防除和利用研究。朱方正等(1994)用石油醚提取并合成紫茎泽兰素,筛选出对单双子叶植物幼苗都有抑制作用的活性化合物。紫茎泽兰提取物防治病虫害的一些研究表明,紫茎泽兰提取物对害虫具有较好的毒杀作用。罗文富等(1999)研究表明,紫茎泽兰汁液对烟草疫霉有较高的抑制效果。烟草疫霉与引起马铃薯晚疫病的致病疫霉是属于同一个属的真菌,因此紫茎泽兰汁液对马铃薯晚疫病菌也应有抑制作用,基于这样的设想,我们开展了紫茎泽兰汁液及其提取物对马铃薯晚疫病菌生长和致病性的抑制作用研究。1材料和方法1.1材料表面紫茎泽兰叶,马铃薯晚疫病菌株ZY15,马铃薯叶片(品种:米拉),25%甲霜灵(江苏宝灵化工股份有限公司)。1.2方法1.2.1紫茎泽兰叶的制备采集新鲜紫茎泽兰叶100g,用自来水洗净,75%的酒精消毒片刻,灭菌水漂洗,剪碎叶片,加400mL灭菌水浸提24h,倒出浸提液,用匀浆机将浸提过的紫茎泽兰叶打碎,用6层纱布过滤,将滤液与浸提液混和,用定性滤纸过滤,将滤液保存于冰箱中备用。1.2.2提取物的制备取滤液50mL,用旋转蒸发仪进行浓缩,得到浓缩物1.22g。另取滤液200mL依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,将萃取物旋转蒸发分别得到浓缩物1.14、0.83、0.14、0.52g。最后剩下的水层旋转蒸发得到浓缩物3.33g。用丙酮将上述浓缩物溶解,用蒸馏水调成浓度为10%的浓缩物溶液(以下简称紫茎泽兰萃取液),再把丙酮蒸发掉,保存于冰箱中备用。1.2.3准备细菌的准备将保存的马铃薯晚疫病菌ZY15穿薯片恢复菌株活性,纯化培养于燕麦番茄汁培养基中备用。1.2.4不同浓度的山梨酒精胞的制备挑取培养10d左右的晚疫病菌菌丝放入盛有灭菌水的小烧杯中,搅拌使孢子囊脱落,用挑针把菌丝挑出,摇匀,用血球计数器测定孢子囊数目,把孢子囊悬浮液浓度调到2000个孢子囊/mL。1.2.5大麦番茄汁的制备燕麦80g,番茄汁150mL,琼脂粉10g,碳酸钙1.2g,蒸馏水1000mL,pH值7.0。1.2.6马铃薯晚疫病菌抑菌效果测定取紫茎泽兰提取液各200μl于20mL的燕麦番茄汁平板培养基中均匀摊平。用灭菌水代替紫茎泽兰提取液作对照。再用打孔器从平皿中取培养10d左右的马铃薯晚疫病菌ZY15(直径4mm),置于燕麦番茄汁平板培养基中央,每处理3次重复,在17℃培养箱内培养8d,测定菌落直径,计算各提取液的抑菌效果。抑制效果(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100。1.2.7马铃薯叶片发病设计6个处理:紫茎泽兰汁液与25%甲霜灵混合液(用灭菌的紫茎泽兰汁液作溶剂,使配制混合液相当于甲霜灵800倍液),紫茎泽兰汁液灭菌(保存6个月),紫茎泽兰汁液(新提取,未灭菌),紫茎泽兰汁液(新提取,灭菌),25%甲霜灵(800倍液),灭菌水(CK),见表2。感病品种米拉播于盆中,待植株生长30d左右,从植株上采大小一致的叶片进行离体叶片接种。将马铃薯叶片用酒精消毒后,用灭菌水漂洗,用吸水纸把水吸干,叶背朝上置于0.8%的水琼脂平板上。先在叶背的叶脉两侧各滴25μl处理液,同时再吸取晚疫病菌孢子囊悬浮液25μl滴于处理液上使之混和,以滴加灭菌水代替处理液作对照。每处理6次重复。将平皿置于17℃培养箱内培养过夜,第二天翻过叶片,在白天光照晚上黑暗的培养箱中培养4d后,观察记录发病情况。抑制效果(%)=[(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积]×100。2结果与分析2.1有机溶剂的影响实验表明,从紫茎泽兰汁液中提取的物质溶液对晚疫病菌均有不同程度的抑制作用。其中石油醚萃取液的抑制效果最好,达到44.42%。显著高于氯仿萃取液、水层液和正丁醇萃取液,并与对照有极显著差异。除石油醚萃取液外,其他处理没有极显著差异。丙酮溶液、石油醚溶液与对照没有显著差异,说明丙酮和石油醚本身没有抑菌作用。石油醚溶液与石油醚萃取液有显著差异,氯仿溶液与氯仿萃取液没有显著差异,乙酸乙酯溶液与乙酸乙酯萃取液有显著差异,正丁醇溶液与正丁醇萃取液没有显著差异。这说明某些有机溶剂对提取物可能有一定的影响(表1)。用灭菌水、丙酮溶液、石油醚溶液、氯仿溶液、乙酸乙酯溶液处理的菌丝生长良好,其他提取液处理的菌丝生长受抑制。乙酸乙酯萃取液、紫茎泽兰汁液、氯仿萃取液处理的菌丝较稀疏,用石油醚萃取物处理的菌落直径最小,菌丝不明显(图1)。镜检发现用紫茎泽兰提取液处理过的菌丝的产孢量明显低于对照。2.2不同处理对晚疫病菌致病性的抑制效果实验表明,紫茎泽兰汁液和25%甲霜灵混和使用效果最好,抑制效果达到95.43%;甲霜灵单独使用的抑制效果显著高于紫茎泽兰汁液的抑制效果;紫茎泽兰汁液灭菌与未灭菌、新提取汁液与保存一段时间的汁液之间没有显著差异;各处理液与对照均有极显著差异,各处理液对晚疫病菌致病性的抑制效果均达到50%以上(表2)。镜检发现,对照和紫茎泽兰灭菌汁液处理的叶片有少量孢子囊,其他处理均没有孢子囊。3紫茎泽兰汁液本实验用有机溶剂提取紫茎泽兰的活性物质,提取液对马铃薯晚疫病菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用,其中石油醚萃取液的抑菌效果最好。表明石油醚萃取法优于其他方法,但是否最好有待研究。用有机溶剂的溶液做对照处理时,结果显示某些有机溶剂对马铃薯晚疫病菌菌丝生长有轻微的抑制作用。因此用有机溶剂提取物质的过程中,应该考虑到有机溶剂对提取物作用的影响,尽量避免有机溶剂的残留。另外进行了紫茎泽兰汁液对马铃薯晚疫病菌致病性的影响实验。实验结果表明,紫茎泽兰汁液对晚疫病菌的致病性有一定的抑制作用,其中25%甲霜灵与紫茎泽兰汁液混和使用效果最好。25%甲霜灵与紫茎泽兰汁液单独处理时,紫茎泽兰汁液的效果比不上甲霜灵。甲霜灵一直以来都是防治马铃薯晚疫病的有效农药,但长期施用会导致抗药性菌株的产生。植物源农药与化学农药的交替使用或混和施用不仅可以提高防治效果,还可以阻止或减缓抗药性菌株的产生。在紫茎泽兰汁液对马铃薯晚疫病菌致病性实验中,镜检发现对照和紫茎泽兰灭菌汁液处理的叶片有少量孢子囊,其他处理均没有孢子囊。这说明紫茎泽兰汁液灭菌后某些活性成分的活性可能丧失了。A.Kumar(1991)报道大麻叶泽兰(E.cannabinum)汁液对德巴利腐霉(Pythiumderbaryanum)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)和齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)等都有较强的抑制作用。B.M.Ratnayake等(1992)从河岸泽兰(E.riparium)提取6-乙酰基-7,8-二甲氧基-2,2-色原烯乙烷,对炭疽病菌(Colletocterichumgloeosporioide)、烟草硅眼病菌(Cercosporanicotianae)和芽枝霉(Cladosporumcladosporiodes)等都有较强的抑制效果。紫茎泽兰与上述泽兰属于