丝裂霉素c治疗准分子激光屈光性角膜切削术后角膜上皮下雾状混淆作用的实验研究

丝裂霉素c治疗准分子激光屈光性角膜切削术后角膜上皮下雾状混淆作用的实验研究

准分子激光折叠成像（prk）切割组织准确，安全性好，预测性好，光谱稳定。它已成为治疗中、低度视力改善的主要方法，并取得了良好的效果。然而,该手术存在的主要问题是角膜上皮下雾状混浊(haze),它不仅影响术后视力而且造成屈光回退,亟待解决。本实验通过局部应用0.2g·L-1丝裂霉素C(mitomycinC,MMC)溶液滴眼,并与1.0g·L-1地塞米松溶液进行对比,观察药物对PRK后haze形成的影响,以寻找一种新的防治haze安全有效的方法。1材料和方法1.1下其它大鼠眼新西兰白兔41只(由南京军区总医院实验动物中心提供),体重2.1～3.0kg,无眼部病变,雌雄兼用,随机分为3组,每组27眼。Ⅰ组为MMC组,Ⅱ组为地塞米松组,Ⅲ组为对照组。1.2jcm-2加削法30g·L-1戊巴比妥钠全麻兔后,用PTK法(频率13.0Hz,能量密度180mJ·cm-2)去除角膜中央8mm直径上皮。然后行PRK,切削参数:-9.00D,深度97μm,直径7mm,频率10Hz,能量密度120mJ·cm-2。使用激光器为美国Coherent公司生产的SchwindKeratom-F型准分子激光治疗机。1.3l-2mmc/l-1地塞米松滴眼术毕所有眼涂金霉素眼膏。术后第1天始,Ⅰ组用0.2g·L-1MMC滴眼,每日4次,共14d;Ⅱ组用1.0g·L-1地塞米松滴眼,术后1～4周,每日4次,术后5～8周,每日2次;Ⅲ组滴平衡盐液,每日4次,共14d。1.4术后观察1.4.1皮质愈合时间每天观察眼前段情况,滴10g·L-1荧光素钠染色检查角膜上皮直至其完全愈合,记录角膜上皮愈合时间。术后1、4、8周检查haze情况,同时摄取角膜像,按Fants等级分类法分5级并记分,即0级为0分,0.5级为0.5分,1～4级分别为1～4分。1.4.2膜成像及内科医生术后1、4、8周行角膜中央内皮检查,观察内皮细胞形态改变、细胞密度、六角形细胞百分率及细胞面积变异系数。1.4.3标准染色—光学显微镜检查术后1、4、8周随机活杀兔取术区角膜,其1/2置于100g·L-1中性甲醛液固定,常规石蜡切片,HE染色。观察角膜上皮再生、基质成纤维细胞及纤维排列情况。1.4.4透射电镜检查取上述角膜片的另1/2浸于25g·L-1戊二醛液固定。观察角膜组织的超微结构改变。1.5ze积分的差异所有数据采用SPSS软件包进行统计学处理。用秩和检验分析各组haze积分的差异。角膜上皮愈合时间、内皮细胞密度、内皮细胞面积的变异系数、内皮六角形细胞百分率等数据,用单因素方差分析进行总体均数的显著性检验,对有差异者采用q检验分别进行2组间均数的显著性检验。2结果2.1审查中的裂缝灯2.1.1膜过渡时间3组均于术后5～6d完全愈合,经统计学分析差异无显著性(P>0.05)。2.1.2各组haze普遍加重术后1周,各组haze积分平均值均为0～0.5分,经统计学分析差异无显著性(P>0.05)。术后4周,各组haze普遍加重,术后8周仍明显,均以Ⅲ组为最明显(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ组差异无显著性(P>0.05)。各组不同时间段haze积分平均值变化见表1。2.2前基质成纤维细胞增殖情况术后1周,Ⅰ组和Ⅱ组可见4～6层上皮细胞,上皮形状及排列较规则,前基质层见中等量成纤维细胞,纤维排列较整齐;而Ⅲ组可见5～7层上皮细胞,上皮细胞排列紊乱、形状各异,前基质成纤维细胞明显增多,呈活跃增殖状态,纤维排列紊乱,新生基质厚度大于Ⅰ组和Ⅱ组。术后4周,Ⅲ组上皮细胞7～9层,基底细胞大小不一,呈不规则柱状结构,前基质成纤维细胞明显增多,功能活跃,胶原纤维增生、排列紊乱明显,纤维间隙较大;Ⅰ组和Ⅱ组上皮细胞5～7层,细胞大小基本均匀,前基质成纤维细胞数较术后1周时为多,但明显少于Ⅲ组,纤维排列轻度紊乱。术后8周,光镜下改变基本同第4周。3组不同时间段后基质层、Descement膜和内皮层均未见异常。2.3胶原纤维的形态变化术后1周,Ⅲ组上皮基底细胞异常增大,核分裂像增多,上皮细胞内大量扩张的粗面内质网、明显肿胀的线粒体及呈网状分布的微丝;前基质见大量成纤维细胞,细胞肥大、胞浆丰富,胞浆内空泡形成。扩张的粗面内质网增多明显,线粒体肿胀,高尔基体发达,且含有丰富的微管、微丝。核淡染,染色质着边,细胞周围可见新合成的胶原纤维,其粗大、疏松、排列紊乱,呈交叉排列。Ⅰ组和Ⅱ组电镜下改变基本相同,与Ⅲ组比较上皮细胞核较少见,细胞分裂无亢进,细胞内可见中等量细胞器,前基质成纤维细胞数较少、核分裂像不明显,胶原纤维排列轻度紊乱。术后4周,Ⅲ组上皮基底细胞仍增大,前基质仍有大量增生活跃的成纤维细胞,细胞周围可见较多排列紊乱的胶原纤维,粗细不均、分布疏松,失去了板层结构,瘢痕形成。Ⅰ组和Ⅱ组上皮基底细胞核分裂像仍可见但不及Ⅲ组明显,前基质成纤维细胞内细胞器明显减少,纤维排列较Ⅲ组明显整齐。术后8周,Ⅲ组前基质仍有较多成纤维细胞,形态向扁平型恢复,但增生仍活跃,胞浆内仍见较多肿胀的线粒体及扩张的粗面内质网,细胞周围纤维排列仍紊乱。Ⅰ组和Ⅱ组纤维排列较整齐但纤维粗细欠均匀,前基质成纤维细胞较少,增生不活跃。3组各时间段后部基质、Descement膜及内皮层均末示异常。2.4不同形态细胞形态及细胞密度、细胞密度及六角形细胞率术前及术后1、4、8周,3组角膜正中内皮细胞形态、细胞密度、细胞面积变异系数及六角形细胞率均无明显改变(表2～4)。经统计学分析,3组间差异无显著性(P>0.05)。3prk治疗haze的临床应用角膜haze是PRK后主要并发症,往往伴随屈光回退,严重时导致视力和对比敏感度降低,影响PRK手术的预测性和稳定性,因而日益受到人们关注。目前临床上普遍应用皮质类固醇激素滴眼,但其效果尚存在争议,且长期应用可引起激素性青光眼、白内障等一系列严重并发症,因此有必要寻找一种更为安全有效的药物。目前对PRK后角膜伤口愈合过程的研究表明,haze形成的主要原因为:上皮过度增殖,前基质成纤维细胞数量增多且合成功能活跃,有新的细胞外基质合成以及新生胶原纤维排列紊乱。因而适当地对其伤口愈合进行调节有助于减轻haze的形成和发展。MMC是一种烷化剂,能破坏DNA结构和功能,并抑制RNA的合成,尤其是对合成前期和合成期最敏感,抑制作用较强,因而能阻止成纤维细胞增殖及产生胶原物质,防止瘢痕形成。国内外文献报道低浓度即0.2g·L-1丝裂霉素C滴眼,很少发生并发症,使用安全,已应用于防治青光眼滤过性手术后滤过泡瘢痕形成、胬肉切除术后复发及防止泪道探通术、泪囊鼻腔吻合术后再阻塞,并取得显著效果。张建华等的实验发现,MMC对PRK后兔角膜成纤维细胞生长有强烈的抑制作用。为此我们于PRK后局部应用MMC。本实验结果表明,PRK后应用0.2g·L-1MMC溶液滴眼,治疗组角膜上皮细胞、成纤维细胞的过度增殖及胶原纤维合成均受抑制,haze程度减轻;与应用1.0g·L-1地塞米松滴眼治疗相比,其减轻haze的作用相似,说明MMC可通过抑制角膜上皮细胞和成纤维细胞的过度增生及胶原纤维的合成,从而减轻haze的形成。Palmer经实验证实0.2g·L-1MMC并不产生临床上的角膜上皮毒性作用。我们通过裂隙灯显微镜、光镜、电镜及角膜内皮镜等检查,均未发现此剂量MMC对角膜的副作用,而且角膜上皮