高效液相色谱-四极杆质谱法测定烟草特有亚硝胺

高效液相色谱-四极杆质谱法测定烟草特有亚硝胺

关于烟草中独特的亚硝酸盐（tsnas）的研究始于20世纪60年代，但由于其含量低、烟雾弥漫，对tsnas的精确量化非常困难。TSNAs的分析主要有气相色谱-热能分析仪法(GC-TEA)和HPLC-MS-MS法。TEA不能区分TSNAs和共流出的亚硝胺类化合物,同时TEA检测器有很大的死体积,限制了气相色谱的扫描时间,且该法样品处理复杂、耗时,易造成TSNAs的损失和转化。CHRESTERJANSSON和WEIJIAWU分别用HPLC-MS-MS分析了鼻烟和卷烟主流烟气中的TSNAs。与GC-TEA相比,该法有更大的专一性、更低的检测限和更宽的线形范围,但该法采用二氯甲烷提取烟气总粒相物,样品纯化仍十分复杂。KARLAWAGNER等采用0.1mol/L乙酸铵水溶液选择性萃取截留烟气的滤片,大大简化了样品的处理步骤,降低了处理过程造成的损失和转化,但该法仍然存在适应范围窄,基质效应强等缺点。因此,为更准确地测定卷烟主流烟气中的TSNAs,将KARLAWAGNER法进行了改进,即烟气滤片萃取液经固相萃取纯化后再进行HPLC-MS-MS分析,从而大大降低了基质效应。1材料和方法1.1仪器、试药和仪器FINNIGANLC-MS/MS液质联用仪(美国ThermoElectron公司),配备TSQQuantum三级四极杆质谱仪、Surveyor自动进样器、Surveyor液相泵、电喷雾离子源、Xcalibur液质联用分析软件、QuantumTuneMaster质谱分析软件;RM200吸烟机(德国Borgwaldt公司);KBF240恒温恒湿箱(德国BINDER公司);HY-Bu回旋震荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂);AE240电子天平(感量:0.0001g,瑞士梅特勒公司);MILI-Q-G去离子水仪(美国MILLIPORE公司);OASISMCX(30mg)固相萃取小柱(美国Waters公司)。NNN、NNK、NAT、NAB(标样,纯度≥98%,加拿大多伦多研究化学品公司);d4-NNN、d4-NNK(内标,纯度≥99%,加拿大CDN同位素公司);乙酸(色谱纯,美国DIMA公司);乙酸铵(AR,上海化学试剂有限公司);卷烟样品(购自湖南省常德市当地零售商店,使用前置于密封塑料袋内低温保存)。1.2lc-ms-ms分析按GB/T5606.1-2005选取卷烟烟支,将选取的烟支和剑桥滤片在22℃和相对湿度60%的恒温恒湿箱中调节含水率48h;用吸烟机在标准条件下抽吸卷烟,用剑桥滤片捕集卷烟烟气,每张滤片捕集5支卷烟。吸毕,取出滤片,置于50mL小玻璃瓶中,1张滤片/瓶,加入50μL5μg/mLd4-NNN、d4-NNK内标混合溶液和10mL0.1mol/L乙酸铵水溶液,将玻璃瓶口密封,置于回旋震荡器上室温下以180r/min转速振荡30min。取1.0mL萃取液直接上OASISMCX(30mg)固相萃取柱,用1.0mL50%(体积分数)甲醇水溶液洗脱,洗脱液直接进行LC-MS-MS分析。分析条件为:色谱柱:WatersSymmetryShieldTMRP18(150mm×3.9mmi.d.,5μm);柱温:65℃;流动相:甲醇∶水体系[体积比1∶1,水中添加0.1%(体积分数)醋酸],流速0.25mL/min,等梯度洗脱;进样量:3μL;运行时间:9.0min。离子化模式:电喷雾;喷雾电压:3600V;扫描模式:正离子扫描;扫描时间:0.2s;质谱分辨率:0.7u;离子转移管温度:350℃;鞘气(N2,纯度≥99.995%)压力:0.172MPa;辅助气(N2)压力:0.034MPa;碰撞气(Ar,纯度≥99.999%)压力:0.20Pa;其它条件见表1。2结果与分析2.1基于ms的分子离子方案先采用1.0mg/LNNN、NNK、NAT、NAB的混合标准溶液以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子全扫描,确定NNN、NNK、NNK、NAB的分子离子(表1)信号。然后按QuantumTuneMaster软件设置以MSOnly的模式优化这几个分子离子的喷雾电压、鞘气压力、辅助气压力、离子转移管温度等离子源参数,以MS+MS/MS的模式寻找合适的碎片离子及其相应的碰撞能量(表1)。每个分析物先选择2～3个碎片,再从中选取信号较强、质荷比较大、同时又无相互干扰的碎片定量,其余碎片可在有疑问时辅助定量。2.2色谱峰的灵敏度为选择适宜的色谱条件,用水-甲醇、水-乙腈以及添加乙酸的流动相进行了试验。结果发现,乙酸和水对分析物的灵敏度影响很大。添加0.1%乙酸能较大地提高分析物的灵敏度,同时也可以改善色谱峰的峰形,而增大水的比例则降低了NNN的灵敏度。当采用水-乙腈作流动相时,目标物的保留时间缩短,分离效果不好,不能将目标物和杂质分开,致使无法消除基质效应,而采用添加0.1%乙酸的水-甲醇作流动相时,杂质大多在4min左右流出,分析物在5min以后流出,基质效应得以消除。此外,柱温也会影响NNN的分离,当柱温为20℃时,NNN的峰叉开,而将柱温调到65℃时,可以得到较好的峰形(图1)。2.3样品处理方法的优化2.3.1萃取物的识别为选择合适的萃取溶剂,分别用二氯甲烷和0.1mol/L乙酸铵水溶液萃取烟气粒相物。由两种萃取液的色谱图(图2)可以看出:①乙酸铵萃取液的TIC比二氯甲烷的明显干净;②乙酸铵萃取液TIC中可识别的分析物有NNN、NAT和NNK,而二氯甲烷萃取液TIC中可识别的分析物只有NNK;③二氯甲烷萃取液的TIC中内标d4-NNN的峰受到基质的明显干扰,而在乙酸铵萃取液中内标峰较好。这可能是因为二氯甲烷为中等极性化合物,能萃取的化合物极性范围较广,而乙酸铵水溶液只能将TSNAs等水溶性、弱碱性的成分萃取出来,大部分非水溶性成分则仍保留在滤片上,这可使得萃取液中的成分相对简单很多。因此,选择0.1mol/L乙酸铵水溶液作萃取剂。2.3.2萃取溶剂的选择KARLAWAGNER等在分析2R4F标准卷烟主流烟气中TSNAs时,将乙酸铵萃取液过0.45μm滤膜后直接进行LC-MS-MS分析。然而,本研究发现,该方法并不适应于烤烟主流烟气的分析(图2B),其原因在于烤烟中TSNAs的含量远远低于白肋烟和混合型卷烟,其基质效应相对增强,使得无法对TSNAs进行定量分析,而本研究通过使萃取液过OASISMCX(30mg)固相萃取柱,使得大部分杂质得以分离,从而消除了LC-MS-MS分析时的基质效应,这样本方法不仅能更好地分析白肋烟和混合型卷烟,而且能很好地分析烤烟,较大地扩大了方法的应用范围。同时,由于固相萃取本身的浓缩作用和LC-MS-MS的高灵敏度,因此没必要对固相萃取洗脱液进行浓缩,省去了浓缩过程,不仅节省时间,减少了损失,而且整个处理过程在室温下进行,样品处理过程中TSNAs的损失和转化也降到了最低。2.4标准系列的标定、分析与线性范围准确称取NNN、NNK、NAT、NAB各10mg,分别置于4个100mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成一级标准溶液。准确移取NNN、NNK、NAT一级标准溶液各1.0mL和NAB一级标准溶液0.5mL,均置于1个100mL容量瓶中,用甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,得二级标准溶液;移取0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10mL二级标准溶液和0.5mL内标混合液(5μg/mL)分别至7个100mL容量瓶中,用0.1mol/L乙酸铵水溶液稀释至刻度,摇匀,得系列标准溶液,得NNN、NNK、NAT的浓度范围为0.5～100ng/mL,NAB浓度范围为0.25～50ng/mL。对标准系列分别进行LC-MS-MS分析,并以分析物和内标物峰面积比对相应的质量浓度进行线性回归分析,得到回归方程和相关系数(表2);逐级稀释标准溶液并进样分析,将信噪比等于3时的浓度作为检测限。由表2可以看出,各工作曲线线性良好,适合定量分析。2.5价值分析结果取同一批次已测知含量的卷烟样品3组,每组样品抽吸5支卷烟,用剑桥滤片捕集主流烟气,然后在3组捕集烟气的滤片上分别加入一定量的TSNAs标准溶液,进行样品处理和LC-MS-MS分析,用标准曲线定量,并根据TSNAs的原含量、加标量和加标后的测定量计算其回收率,结果见表3。由此看出,目标分析物的回收率均≥94%,说明本法比较准确,适合定量分析。取同一批次的卷烟样品5组,每组样品抽吸5支卷烟,平行进行样品处理和LC-MS-MS分析,并根据测定量计算平均值和相对标准偏差(RSD),结果见表4。由表4看出,4种TSNAs的RSD均小于7%,说明本法的重复性较好。2.6种进口型钢卷烟与10种进口卷烟型卷烟的比较见表2采用本方法测定了市场上有代表性的12种品牌卷烟烟气中的TSNAs。结果(表5)显示:①在所测定的卷烟中,2种进口混合型卷烟主流烟气中的TSNAs均远远高于10种国产烤烟型卷烟。这是