植物源性真菌植病生防菌盾壳霉的研究进展

植物源性真菌植病生防菌盾壳霉的研究进展

核糖菌是世界上的植物病原体，可以导致408种植物的细菌核心疾病。苯并咪唑类杀菌剂多菌灵因其杀菌谱广、内吸性强、防病效果好,广泛用于该病的防治。但由于病菌抗药性增强和人们对农药残留、环境污染等问题认识程度不断提高,化学农药的使用逐渐受到限制。由于目前抗耐病性的作物材料比较有限,于是人们在生物防治研究方面投入了大量精力。盾壳霉(ConiothyriumminitansCampbell)是1947年美国学者Campbell首先发现并报道的一种重要的菌核寄生菌。盾壳霉因其专一性强、作用时间长、对植物无致病性等特点,而被公认为最具开发潜力的生防菌之一。欧洲市场上已有盾壳霉制剂销售。本文从生态学特性、遗传改良、对核盘菌的生防机制、在菌核病防治上的应用及基因工程研究等方面对盾壳霉的研究进行了综述。1甲壳动物和生态1.1生长和产孢条件对分生孢子萌发的影响不同菌株间在菌落形态,色素颜色,分生孢子器大小、多少及着生方式等方面存在明显差异。尽管菌株间形态差异较大,但其遗传变异性不大。盾壳霉可利用多种碳源和氮源;Mg2+对产孢非常关键。盾壳霉生长和产孢的最适温度均为20℃;高湿度有利于生长和产孢;生长和产孢的最适pH范围在3~6之间;光照对生长没有影响,但光照下菌落和分生孢子器颜色比黑暗条件下深,孢子器及分生孢子成熟也快。盾壳霉孢子萌发需要一定外源营养;在10~25℃范围内均能萌发,最适20℃;高湿条件持续时间越长,孢子萌发率越高;在pH3~8之间均可萌发,最适为6;光照对孢子萌发没有影响。1.2常用的抗菌药盾壳霉主要从土壤中和菌核上采用稀释平板法和菌核诱捕法进行分离。然而常规分离法经常由于其它微生物的干扰而影响盾壳霉分离。为此,Ridgway等(2000)建立了专门检测盾壳霉菌株的PCR方法。盾壳霉可寄生核盘菌属(包括核盘菌、三叶草核盘菌和小核盘菌)、小核菌属(包括白腐小核菌和齐整小核菌)、葡萄孢属(包括蚕豆葡萄孢和灰葡萄孢)真菌的菌丝或菌核。另外,盾壳霉对许多细菌也有拮抗作用。盾壳霉在世界范围内广泛分布。目前至少已从29个国家分离到盾壳霉菌株,隶属于除南极洲外的各洲。国内有报道从东北、内蒙古、山西、四川、湖北、湖南、江西等地分离到盾壳霉。1.3区系中下昆虫、病毒盾壳霉可通过土壤快速传播。水分通过土壤缝隙时可造成垂直传播,水花飞溅可引起水平传播。土壤中的动物区系如弹尾目昆虫、蕈蚊、螨和蛞蝓等对盾壳霉传播也有重要作用。在无节肢动物土壤中,盾壳霉只发生轻微传播。水花飞溅引起的水平传播距离可达2米。节肢动物Folsomiacandida(白色弹尾虫)、Bradysiasp.(尖眼蕈蚊)和Acarussiro(粗脚粉螨)可通过表皮或消化道传播盾壳霉。1.4制约微生物菌核形成的物质在当前的病害防治体系中,单独使用盾壳霉有时不能很好地控制菌核病。此外,在用盾壳霉进行菌核病生物防治时,不可避免地要使用杀虫剂、除草剂等开展杀虫、除草等工作。因此,研究这些农用化学物质对盾壳霉的影响,筛选与盾壳霉相容性好的药剂非常重要。在此方面,Sesan等(1993)测试过20种杀菌剂制剂;Whipps等(2001)测试了6种杀菌剂、4种杀虫剂和1种除草剂;Diamatopoulou等(2000)研究了几种抑制核盘菌菌核形成的物质对盾壳霉的影响;Mischke等(1998)研究了杀虫性光敏色素phloxineB对盾壳霉的影响。1.5土壤生物利用不同土壤中盾壳霉种群数量差异较大。盾壳霉起初受到菌核的保护,但菌核开始降解后可被表面消毒程序杀死或被其它微生物取代。但新近发现次生定殖物只是影响盾壳霉的分离,并没有真正取代之。盾壳霉可在土壤中存活至少3年。然而,最新研究发现它能在土壤汽蒸处理后占据空余的生态位。土壤巴氏消毒或灭菌后土著真菌被大量杀死,因而,盾壳霉的存活要好于不灭菌土中。盾壳霉冬季在加拿大大草原也可存活,当来年土温回升后可继续侵染菌核。研究盾壳霉的群体动态,离不开盾壳霉快速、准确的分离鉴定。许多学者利用现代分子生物学技术在此方面做了一些有益的工作。Gredene(2002)认为用AFLP法较RAPD法和形态生理特征分析对检测盾壳霉种内变异和研究田间动态更有效和可靠。Goldstein等(2000)专为菌株A69设计的PCR引物可用于研究其在土壤中的生态学。Jones等(1999,2003)实现了盾壳霉β-葡糖醛酸酶(uidA)与潮霉素抗性基因(hph)的共转化,并用抗潮霉素B特性研究盾壳霉的存活和对菌核的侵染。1.6不同因素对分生孢子萌发的影响油菜或菜豆的花或叶的提取物可促进盾壳霉孢子萌发、芽管伸长或菌丝生长;通常盾壳霉在油菜花瓣上萌发率很低,但紫外线照射,0.1%升汞或链霉素处理可抑制花瓣上细菌增殖,从而促进盾壳霉孢子萌发。盾壳霉分生孢子可在叶面病部迅速萌发。自油菜叶面上分离到的盾壳霉菌落数随时间延长而降低,但其分生孢子可在叶面存活至少28天。盾壳霉在置于土壤表面的莴苣感病叶片上生殖较好,而在其它条件下虽也可存活,但分离率大大降低。2甲壳动物-真菌的预防机制2.1合理确定菌核及其处理工艺据报道,盾壳霉可在核盘菌的子囊孢子侵染植物叶片后,寄生茎杆内部及表面的菌丝和菌核。用光学显微镜和扫描电镜(SEM)研究均发现盾壳霉菌丝顶端直接侵入寄主菌丝的细胞壁,而不形成特殊结构如附着胞等。Tu(1984)用SEM研究发现盾壳霉可产生附着胞状膨大,但Huang认为这与侵入菌丝无关。盾壳霉菌丝的主侧枝和副侧枝无功能性差别,每种菌丝顶端均可直接侵入寄主菌丝。被侵核盘菌菌丝逐渐收缩、瓦解,并可在寄主菌丝内部发现盾壳霉菌丝(Tu,1984)。盾壳霉的孢子或菌丝都可侵染菌核。可直接侵入,也可经由菌核表面的缝隙侵入。盾壳霉单个孢子即可侵染菌核。寄生菌核时,盾壳霉可在菌核组织的胞内或胞间生长。在侵入点细胞壁有蚀刻,表明盾壳霉侵入皮层组织细胞壁时有化学作用发生。被侵染的菌核髓组织发生质壁分离、胞质聚集、液泡化和细胞壁的降解。后期,盾壳霉可在菌核内大量生长并在菌核表面、紧贴皮层处或偶尔在髓部形成分生孢子器。在此阶段,菌核扁平、发软并开始分解。高俊明等对不同腐烂程度菌核的石蜡切片观察的结果进一步证实了这一点。在盾壳霉侵染菌核后期,处于菌核皮层细胞内的盾壳霉菌丝体逐渐分解,这是由于寄主中营养物质的耗尽、有毒代谢物质的积累,还是其它原因,目前还不清楚。盾壳霉寄生菌核后最终影响到菌核萌发。Tu(1984)发现被寄生菌核既不能萌发菌丝也不能萌发子囊盘。姜道宏等研究表明不同盾壳霉菌株的寄生致腐能力具有分化现象。类似地,Turner等(1976)的研究也发现不同核盘菌菌株的菌核对盾壳霉的敏感性亦不同。盾壳霉在寄生菌核和菌丝体过程中,存在着机械压力和酶解两种作用途径。Phillips等(1983)分别用光镜、透射电镜(TEM)和SEM对接种盾壳霉孢子的菌核进行观察,发现盾壳霉可通过机械压力侵入皮层细胞壁并破坏细胞内含物,而侵入髓部菌丝时靠酶解和机械压力共同作用。2.2b对核盘菌的诱导诱导酶代谢1998年姜道宏等首次报道盾壳霉产生抗细菌物质。近几年发现盾壳霉也可产生拮抗真菌的物质。McQuilken等将盾壳霉液体培养物滤液与PDB按1∶10(v/v)混合后,核盘菌菌丝生长量降低。这是首次明确报道盾壳霉可产生拮抗真菌的代谢物质,并且它的产生与培养液中碳、氮源种类和维生素含量无关。目前,已从盾壳霉培养滤液中鉴定出至少3类代谢物质:3(2H)-苯并呋喃酮类,色烷类和macrosphelideA。其中,macrosphelideA是最主要的代谢物质,对核盘菌和白腐小核菌的IG50分别为46.6和2.9mg·kg-1。然而,这些物质在侵染菌核过程中的作用还不清楚。2.3葡聚糖的降解核盘菌细胞壁中含有β-1,3-葡聚糖和几丁质。然而,盾壳霉培养液中存在β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶,可降解核盘菌的活细胞、离体菌丝及菌核拟薄壁组织细胞的细胞壁。培养液中外切β-1,3-葡聚糖酶活性最强,但其对葡聚糖的降解能力有限,在内切β-1,3-葡聚糖酶的协助下可使葡聚糖彻底分解。在盾壳霉寄生菌核过程中,外切β-1,3-葡聚糖酶基因的表达水平提高。3微生物诱变体的制备对生防菌株进行改良可使用物理诱变(常用紫外线、X射线或γ射线)、化学诱变(常用诱变剂有HNO2、羟胺、烷化剂、亚硝基胍等)、原生质体技术,转座子诱变育种和基因工程育种等方法。Melo等(1996)用紫外线诱变盾壳霉获得具有拮抗核盘菌菌丝生长能力的菌株。Zantinge2003年用紫外线照射盾壳霉野生菌株2134,获得4个β-葡聚糖酶活性提高的菌株。王伍(1997)研究过分生孢子紫外线诱变和60Coγ射线诱变及原生质体紫外线诱变。Jones(1999)成功地将uidA与hph基因共同转入盾壳霉。对盾壳霉的遗传改良可针对不同的目标进行。我们可以以生长快、寄生致腐菌核能力高、抗药能力强或产抗生物质和分泌胞外酶能力强等特性为改良目标。4对其它生防菌的效果在田间和温室的许多作物如莴苣、油菜、向日葵、大豆、菜豆、胡萝卜、芹菜、菊苣、马铃薯和洋葱等所进行的试验都证明了盾壳霉的应用价值。盾壳霉具体的使用方式可以有:播种或移植前进行土壤处理降低病原接种体数量;作物收获后翻耕前在病植株或病残体上喷雾孢子以净化作物;对作物种子进行拌种或包衣;作物生长期进行地上部分喷雾等。另外,探索菌药混用、盾壳霉与其它生防菌结合使用的途径也是值得深入研究的课题。盾壳霉对由不同病原菌引致菌核病的防效评价方法也不同。进行菌丝型萌发的菌核如S.minor,菌核的减少量也就是土壤中接种体减少的量,可用菌核减少量评价防病效果。然而,对进行产果型萌发的菌核如S.Sclerotiorum,由于其通过子囊孢子传播,相对少的菌核群体便可造成相对多的作物受害。因此,衡量其生防能力的唯一正确方法是对病害的预防和/或对作物产量的增加。人们利用盾壳霉防治菌核病已有几十年历史了。自1997年至今,在欧洲市场上已出现两种盾壳霉商品,分别为Contansue5f8(德国Prophyta公司)和KONI(匈牙利Bioved公司)。它们都具有很好的防效,而且持效期长、价格适中,这使得它与其它化学产品的竞争中非常具有竞争力。ContansWG主要登记为土壤使用后防治由S.sclerotiorium和S.minor引起的病害。已有的研究表明,严格按照标签说明使用,对人的健康和环境均无有害影响。Contans已在欧洲一些国家登记。它必须在病害症状出现前2~3个月施于土壤,最好在前作收获时用于作物残体上。这段时间有助于其定殖菌核。5外源基因的影响随着基因工程技术的日趋成熟,从盾壳霉基因组中克隆有益的基因并使其在其它生物体内表达已成为生防工作研究的重点。Lu等(2004)用农杆菌介导法成功地将盾壳霉木聚糖酶基因转入拟南芥,得到10个具除草剂抗性的转化体,转化率达约0.08%。Giczey等从