微生物蛋白质组学

微生物蛋白质组学1精选课件◆蛋白质组学◆猪瘟病毒感染蛋白质组学研究◆病毒感染蛋白质组学研究进展2精选课件第一局部蛋白质组学—Wilkins于1994年提出蛋白质组概念。—蛋白质组比较公认的定义，基因组编码的全部蛋白质。蛋白质组内的蛋白质数目等于基因组内编码蛋白质的基因数目？在一个细胞中，并不是所有基因都是同时表达的，因此，一个细胞的蛋白质组中蛋白质数目少于基因组中基因的数目。另一方面，从基因可变剪切和蛋白质修饰的角度看，蛋白质数目又远远多于基因组中基因的数目。蛋白质组的概念3精选课件蛋白质组学的概念—蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学，旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及其功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式〔修饰方式〕、结构、功能和相互作用等。蛋白质组学与传统的蛋白质研究不同之处：蛋白质组学研究是在生物体或细胞的整体蛋白质水平上进行的，从一个机体或细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和说明生命活动的根本规律蛋白质组研究的意义蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接表达者，对蛋白质结构和功能的研究将直接说明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在方式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间的相互作用以及蛋白质构象等问题仍需要直接对蛋白质的研究来解决。4精选课件蛋白质组学的特点与难点——蛋白质组与基因组的区别与联系■同一性与多样性—基因组作为遗传信息的载体，其最主要的特征就是同一性。对单细胞生物而言，不管在什么条件下，其基因组始终是不变的。对多细胞生物而言，同一个个体的基因组不管是在不同的发育阶段或不同种类的细胞是同样的。—蛋白质是生命活动的主要执行者和表达者，对于不同类型的细胞或同一细胞在不同的活动状态下，蛋白质组的构成是不一样的。5精选课件■有限与无限—对基因组而言，不同物种的基因组，不管其大小，其核甘酸的数量是一定的、明确的。—对蛋白质组而言，一个细胞或生命体蛋白质的种类究竟是多少那么很难确定。●细胞内的大局部蛋白质通常被进行过翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、酰基化等。修饰过的蛋白质具有其特定的物理化学性质和生物学功能。对蛋白质修饰的研究构成了蛋白质组学的一个分支：修饰蛋白质组学。●如果说表达的蛋白质的种类可以根据基因的数目来确定，那么修饰形成的蛋白质种类只有依靠对蛋白质的直接研究来决定，而这种研究是没有止境的，因为蛋白质的修饰与生命的活动密切相关。从这种意义上来讲，对基因组核甘酸序列的测定是一种“有限〞的工作，而对蛋白质组的蛋白质种类确实定那么是一种“无限〞的工作。蛋白质组学与基因组学的区别与联系6精选课件■静态与动态—一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。而作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组，在个体的生命活动中却总是变动不停。人们可以通过确定变化的蛋白质来理解其功能。因此，蛋白质研究的一个重要任务是，找出蛋白质组里发生了变化的蛋白质。—生命活动中的蛋白质可大致分为两类：一类是比较稳定的，如负责细胞各种结构组成的蛋白质。一类是随细胞的活动和状态发生量或质变化的蛋白质，如负责信号转导或细胞活动调控的蛋白质。在这种意义上，人们把以研究蛋白质变化为主的蛋白质组学称为功能蛋白质组学。其主要是比较在不同生长状态下或病理状态下的同一种细胞或组织的蛋白质组内的差异蛋白质。与此相对应，测定一个细胞或组织含有的全部蛋白质种类的研究就是通常所说的蛋白质组学。蛋白质组学与基因组学的区别与联系7精选课件■时间与空间—DNA通常位于细胞核内，且保持稳定，因此测定基因组的DNA序列不受时空影响。对于转录的mRNA来说，时间是主要的参考因素，在发育的不同阶段或细胞的不同活动时期，mRNA的表达是不一样的。因此，在研究转录组或基因芯片时必须考虑到时间，但通常不需考虑空间的影响。—在蛋白质组的研究中，不仅要考虑时间的因素，更要考虑空间的影响。

首先，不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，其功能与其空间定位密切相关。

其次，许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，它们在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里的运动发挥作用。如细胞的信号传导和转录调控也常常依赖于蛋白质在空间位置的变化和运动。因此，蛋白质组学中又派生了一个与空间紧密相关的新研究领域：亚细胞蛋白质组学。这种亚细胞蛋白质组可能是细胞器蛋白质组，如高尔基体蛋白质组，也可能比细胞器还要小的组分，如核膜。8精选课件■孤立行为与相互作用—基因组的基因表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不干扰。—蛋白质彼此间有着广泛的相互作用，不存在不与其他蛋白质发生作用的“孤立蛋白质〞。蛋白质的功能实现离不开蛋白质与蛋白质或蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用。●蛋白质组研究的一个主要内容是研究大规模的蛋白质的相互作用：相互作用组。●相互作用组研究可分为两类：研究蛋白质相互作用的网络：酵母双杂交、噬菌体显示和蛋白质芯片技术研究蛋白质复合体组成的分析，包括结构型的蛋白质复合体，如核孔复合体，这一类比较稳定。另一种那么是功能型蛋白质复合体，如负责转录的转录蛋白复合体或负责DNA复制的复制蛋白复合体，这类复合体只有在执行功能时才聚合在一起，因此很不稳定。9精选课件■单一手段与多种技术—基因组既无量的变化，也没有质的变化。在基因组研究中，DNA测序技术是一个最根本和最主要的工具。—蛋白质组研究技术的难度远远大于基因组研究技术，可简单地分为两大类，第一类是蛋白质的别离技术，包括双向电泳技术、细胞的分级别离技术、亲和层析技术等蛋白质组研究技术等。蛋白质组别离面临着蛋白的量和质两方面的难点。第二类是蛋白质组的鉴定技术，其核心是质谱技术。现有鉴定技术面临的最大问题是，它们都依赖于的蛋白质或基因的序列作为检测的根底，通过比较来确定待测定的蛋白质。对于在已有的数据库中没有记载的全新蛋白质进行“从头测定〞是一个很困难的任务。总之，蛋白质组对技术的依赖和要求远远超过基因组学。蛋白质组学的开展是受技术限制的，也是受技术推动的。10精选课件■互补与互助—在后基因组时代，蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域。基因组与蛋白质组之间既为互相补充又能互相帮助。—mRNA是介于基因和蛋白质之间的中间产物。因为mRNA既是基因的产物，又比蛋白质要容易分析，所以，研究mRNA的表达模式也是了解基因组和蛋白质组的一个重要途径。由此专门形成了一个新的研究领域：转录组。研究转录组的主要手段是基因芯片技术、SAGE〔基因表达序列分析〕技术。—蛋白质组的许多工作也离不开对基因组的研究，在蛋白质组的相互作用研究中表现尤为突出。双杂交技术、噬菌体显示技术等就是以基因组数据和技术为根底的。11精选课件蛋白质组学技术

蛋白质别离蛋白质鉴定生物信息学:蛋白质序列数据库、蛋白质功能数据库等基于凝胶非凝胶双向电泳〔2DE〕微流芯片多维色谱毛细管等电聚焦质谱技术三大支柱12精选课件双向电泳和差异凝胶电泳

■双向电泳〔Twodimensionelctrophresis,2DE〕是根据不同蛋白质等电点和分子量的不同利用第一向等电聚焦和第二向SDS电泳将蛋白质混合物中的各种蛋白别离开。■差异凝胶电泳〔differentialgelelectrophoresis,DIGE〕是在2DE根底上建立的蛋白质别离技术。该方法将待比较的两个样品蛋白质分别用不同的荧光染料(Cy2、Cy3、Cy5)进行标记后，等量混合再进行双向电泳。由于荧光染料的发光波长不同，可以在一块凝胶上检测两个样品，并通过蛋白点不同荧光信号间的比率确定蛋白量的差异。凝胶分离技术蛋白质别离技术13精选课件色谱与质谱联用技术

色谱与质谱联用就是将蛋白质混合物通过液相色谱别离并收集样品中的特定组分，然后再借助质谱进行分析，获得特定蛋白质的分子量信息并对蛋白质进行鉴定。目前，液相色谱串联质谱联用、反相液相色谱－离子交换色谱－反相液相色谱－串联质谱三维联用等色谱与质谱联用技术已广泛用于蛋白质组学研究。非凝胶分离技术14精选课件蛋白质芯片与质谱联用技术

外表增强激光解析电离质谱(surfaceenhancedlaserdesorptionionization-massspectrometry,SELDI-MS)就是将蛋白质芯片与质谱相结合的蛋白质图谱分析技术。该技术可直接将血清、尿液、组织提取物等蛋白质混合物与不同化学外表〔疏水、亲水、阳离子、阴离子、金属离子螯合〕和生物外表〔抗原－抗体、受体－配体、DNA-蛋白质〕的蛋白质芯片相结合而将蛋白质别离，然后用SELDI-MS对别离的蛋白质进行鉴定。根据质谱图可得到蛋白的分子量及相对强度，分析不同样品的差异蛋白。与2DE相比，该方法可以检测到低丰度的蛋白质、需时短并适于微量样品的分析。非凝胶分离技术15精选课件16精选课件17精选课件生物质谱技术与蛋白质鉴定在蛋白质组学研究流程中，蛋白质的鉴定是最关键的一环。蛋白质鉴定的主流技术就是生物质谱技术。就技术而言，蛋白质研究技术比核酸研究技术要相对复杂和困难得多，不仅氨基酸残基种类远远多于核苷酸残基，而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰如磷酸化、糖基化等，这给别离分析带来很多困难。20世纪80年代末在生物大分子领域得以广泛应用的质谱技术那么与Edman降解氨基酸测序使蛋白质一级结构得以说明、NMR的出现推进了对蛋白质溶液构象的解释一样，是蛋白质研究领域的里程碑。18精选课件对蛋白质和多肽而言，质谱技术就是要确定一个蛋白质或多肽的分子质量。分子质量是一个蛋白质、多肽或氨基酸最根本的特征，这种特征是专一的。不同的氨基酸组成、不同的氨基酸序列、不同的修饰方式、不同的蛋白质间结合方式、不同的位点差异都可以在蛋白质的分子质量上得以表达。对蛋白质以及组成蛋白质的多肽，氨基酸的分子质量测定实际上就是对蛋白质种类和性质的鉴定。质谱技术的根本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比〔m/z〕的差异来别离并确定分子质量。一台质谱仪一般由进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。其中，离子化源和质量分析器是两个中心部件，不同类型的质谱仪主要就是根据这两个部件命名的。19精选课件飞行时间质谱〔TOFMS〕由离子源〔S〕引出极、漂移区〔D〕和检测器组成。当离子在离子源内形成后在离子源内电场E的作用下进入无场漂移区。在理想状态下，所有进入漂移区的离子具有相同的动能〔KE〕.测定离子在漂移区内的飞行时间即可计算出它的质荷比。基质辅助激光解吸离子化是将样品均匀包埋在固体基质〔a－氰基－4－羟肉桂酸〕中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带局部样品分子进入气相，并将一局部能量传递给样品分子使其离子化。基质辅助激光解析离子化质谱仪〔MALDI-TOF/TOF-MS〕检测器加速电压＋＋＋引出极漂移管D离子源DS飞行时间质谱示意图20精选课件21精选课件■

质谱法结合数据库检索对多肽和蛋白质进行鉴定这一方法的理论根底是认为每个蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后，同一时间获得所有肽段分子质量而形成一个肽段分子质量图谱，这一图谱对蛋白质应是专一而特异的，因此肽质量指纹图谱〔peptidemassfingerprinting,PMF〕。这一方法不需对图进行人工解析，只需将实验获得的PMF与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质。因此比传统方法速度快、通量高，是最早用于大规模蛋白质鉴定的质谱方法，也是目前最简便的蛋白质鉴定方法之一。22精选课件

双向电泳制备原那么：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态〔包括多数疏水性蛋白〕，且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰〔如酶性或化学性降解等〕。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。双向电泳分析中的样品制备23精选课件制备原那么：双向凝胶电泳第一向为等电聚焦〔IEF〕，根据蛋白质等电点进行别离；第二向为SDS凝胶电泳〔SDS〕，根据蛋白质的相对分子质量进行别离。所以，在样品制备过程中，一切影响等电聚焦和凝胶电泳的因素都应该考虑在内。有效的可重复的样品制备是双向电泳成功的关键。24精选课件可溶性样品

固体组织样品

细胞不同样品的根本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行别离。25精选课件样品的溶解溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液〔否那么样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降〕；2、溶解方法必须去除可能干扰2-DE别离的盐、脂类、多糖和核酸等物质；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。是2-DE成功别离蛋白质的最关键因素之一。26精选课件增加样品溶解性的手段为获得最正确的双向电泳别离结果，样品一般使用促溶剂、去污剂、复原剂、IPG缓冲液和两性电解质等将其变性并充分溶解。变性剂：尿素和硫尿是最常用的变性剂，其主要作用是改变氢键或次级键的结构，使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使用，可大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性。硫脲和尿素有效地破坏了疏水键，防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性。27精选课件外表活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种外表活性剂来溶解疏水基团。外表活性剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止等电聚焦时析出。原那么上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂SDS不利于等电聚焦，但是SDS缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，所以一般只用于样品处理的初级阶段，浓度不高于0.3％时，对等电聚焦不会产生太大影响。非离子型去污剂TritonX-100和NP-40以前应用较多，现多用兼性离子去污剂CHAPS，CHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更强，其使用浓度一般在1％－2％。28精选课件复原剂：在变性剂和外表活性剂联用条件下，加用复原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。复原剂主要用来断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦〔TBP〕进行复原。其中DTT是使用比较广泛的复原剂，在50mmol/L时能有效地复原大局部的二硫键。29精选课件起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和外表活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否那么这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子，离心时还有助于核酸的沉淀。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％〔w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。30精选课件样品液的准备标准液：ReagentAmount8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBPstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytesSeenexttable0.0002%bromophenolblue100ulof0.1%stockddH2OTo50ml31精选课件IPGpHRangeBio-LyteAmpholyte(stock)rangeBio-LyteAmpholyte(stock)Conc.(w/v)SampleSolutionVolumePer5mlSampleSolutionVolumePer50ml3-103/1040%25

l250

l4-74/640%12.5

l125

l5/740%12.5

l125

l3-63/540%25

l250

l4/640%12.

l125

l5-85/840%25

l250

l7-107/940%12.5

l125

l8/1020%25

l250

lSuggestedBio-lyteampholytecompositionforIPGuse32精选课件ReagentAmount7Murea4.1mlof8.5stockor2.1gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock4%CHAPS200mg0.2%carrierampholytesSeetable0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplechaotropicagentsolutionpreparation33精选课件ReagentAmount5Murea2.9mlof8.5stockor1.5gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrierampholytesSeetable40mMTris24.2mg0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplesurfactantsolutionpreparation34精选课件样品中核酸的去除对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质〔SCA〕同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。35精选课件亚蛋白质组样品的制备用超离心技术别离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对别离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。36精选课件亚蛋白质组样品的制备顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含复合外表活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%〔W/W〕。37精选课件特殊样品的制备低丰度蛋白的别离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加别离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响别离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备技术进行别离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的别离。38精选课件强碱性蛋白质〔如核糖体〕的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条〔如pH3－12、4-12或10-12〕进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶〔如pH10-12〕的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶〔如pH3-12、4-12〕等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcylsulfateions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。39精选课件一维固相pH梯度等电聚焦〔IEFwithIPG〕：蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。40精选课件一维固相pH梯度等电聚焦〔IEFwithIPG〕：41精选课件等电聚焦〔IEF〕电泳就是在凝胶中参加两性电解质，从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。一维固相pH梯度等电聚焦〔IEFwithIPG〕：42精选课件43精选课件44精选课件一维固相pH梯度等电聚焦〔IEFwithIPG〕：IPG〔(ImmobilizedpHGradient,IPG)〕胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF别离到达真正的平衡状态。45精选课件IPG胶的重泡涨2-DE样品重泡涨溶液重泡涨溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG缓冲液

(两亲性电解液)0.28%DTT微量

溴酚蓝IPG胶条支架IPG

胶条定位泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。46精选课件蛋白载样量影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度样品的复杂度复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后那么更易分析。IPG胶条的pH范围47精选课件IPG胶条的蛋白质大约载样量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100

g/125

l200~500ug/125

l11cm50~200

g/185

l250~1000ug/185

l17cm100~300

g/300

l1~3mg/300

l48精选课件•不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围•pH7-11NL碱性胶条IPGIEF中pH梯度的选择49精选课件IPGIEF中pH梯度的选择常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。宽pH梯度用于：

全部蛋白(确定感兴趣蛋白

的大致位置)窄pH梯度用于：

提高分辨率增加载样能力以检测、分析

更多蛋白50精选课件51精选课件52精选课件53精选课件54精选课件55精选课件18-20hIPG水化上样56精选课件杯上样&纸桥上样杯上样：有些情况下，需要在水化之后加样，然后立即进行IEF电泳，例如，如果担忧发生蛋白质水解或其他蛋白质修饰，样本经过过夜的水化过程就不适宜了。使用碱性ImmobilineDryStrip凝胶时，阳极样本杯上样可改善双向电泳斑点图像。纸桥上样：纸桥上样适合于非常大量的样本和制备电泳，特别是采用碱性pH范围时。57精选课件★IPGphor包括半导体温控系统(20°C)和程序化电源(10000V)★可同时进行12根胶条的等电聚焦★聚焦效果以“Vh〞数控制，可提高重复性IEF电泳58精选课件59精选课件聚焦时间的优化

理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最正确时间是IEF别离到达稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶外表渗出〔电渗〕而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丧失。最正确时间确实定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。60精选课件IEF的根本条件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid61精选课件两维间的平衡

一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于－80°保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被别离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS是电泳能顺利进行。建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris〔pH8.8〕缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。•第一步DTT平衡：使变性的非烷基化蛋白处于复原状态(1x15min)1%DTT•第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的DTT，防止拖尾(1x15min)2.5%iodoacetamide62精选课件二维SDS同普通SDS类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶〔低浓度丙烯酰胺胶〕充当了浓缩胶。63精选课件二维SDS低熔点琼脂糖64精选课件SealtheCassetteandFixtheIPGStripwithAgarose65精选课件InsertingtheCassette66精选课件67精选课件聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测理想显色剂的7S平安〔safety〕：灵敏〔sensitivity〕：简单〔simplicity〕：特异性〔specificity〕：快速〔speed〕：稳定〔stability〕：兼容性〔synergy〕：68精选课件有机染料和银染考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为8~10ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯〔PVDF〕和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。69精选课件负染能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快〔5~15min〕，蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。该技术主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用。70精选课件胶体扩散染料主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。71精选课件有机荧光团染料包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料。这三种染料可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成，灵敏度为2~10ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。72精选课件金属螯合染料这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台〔包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等〕相结合。其中SYPRORuby也是一种基于钌的金属发光染料。73精选课件凝胶的图像处理分析和典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：74精选课件蛋白质的胶内酶切

包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程75精选课件实验方法完整蛋白质〔如凝胶别离或色谱纯化蛋白质〕肽混合物质谱测定肽质量〔MALDI-MS,ESI-MS)选择肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)计算方法蛋白质序列数据库〔＋核酸序列翻译数据库〕肽质量检索未解析碎片离子检索酶切质谱鉴定蛋白质的策略76精选课件生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳别离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得77精选课件

孙金福

猪瘟病毒感染蛋白质组学研究

第二局部78精选课件■

CSFV是猪瘟的病原，CSF是以出血性高热、淋巴细胞减少和免疫抑制为主要特征的传染病。近年来，CSF多呈温和、慢性、非典型、持续感染特征，隐性感染母猪导致流产、死胎，给养猪业造成重大经济损失。

临床病症:发热,白细胞减少,皮下、粘膜和内脏器官出血CSFV感染蛋白质组学79精选课件■

为了寻找CSFV感染、致病相关蛋白，揭示CSFV的致病机制,本研究用高通量蛋白质组技术——2DE、2DDIGE和质谱鉴定分析了感染CSFV体外细胞PK-15、体内细胞PBMC和感染猪血清的蛋白质组变化。■目前,关于CSFV致病机制的研究多集中在病毒的自身毒力及宿主免疫反响方面，关于CSFV感染致病过程中宿主因素变化的报道较少。实际上，病毒的致病是病毒与宿主相互作用的结果，病毒的侵入会导致宿主细胞蛋白表达模式的改变，这种改变将影响宿主细胞的正常生理功能并决定病毒的致病进程和结果。CSFV感染蛋白质组学80精选课件CSFV感染PK-15细胞蛋白质组分析AB2081精选课件实验方案2-DE

图像分析MALDI-ToFMS/MS

差异表达蛋白的验证差异蛋白功能注释

裂解细胞PK-15cellsPK-15细胞

图像分析

等电聚焦PAGE82精选课件1样品制备与定量1.1样品制备用猪瘟病毒石门株血毒〔1×105TCID50/0.1mL〕接种PK细胞，每瓶〔4×7mm〕细胞接种2×105TCID50。于接种病毒后48h，用细胞裂解液〔8M尿素、4％CHAPS、40mMTris、65mMDTT、10mM蛋白酶抑制剂〕裂解感染细胞，裂解液收集于1.5mL小离心管。图1.1

简接免疫荧光法检测CSFV感染的PK-15细胞.(A)、(B)、(C)、(D)分别为感染后24h、36h、48h、60h的细胞样品.CDcontrolAB1.2样品定量各实验组样品经超声处理并离心〔20000g,15min〕后，用Bradfordassay法〔Bio-RadEttan2-DQuant试剂盒〕进行蛋白质定量。83精选课件IPG(immobilizedpHgradient)胶条〔17cm,PH3-10,BIO-RAD)水化：适量水化液与150µg样品混合，使总体积为350µL/strip,参加持胶槽，然后将IPG胶条放入持胶槽，防止有气泡产生，放入胶条后，往胶槽加满矿物油。在50V电压条件下主动水化12h－16h。胶条水化后，在50µA/strip，20℃条件进行等电聚焦电泳。〔不同的电泳系统，上样方法不同〕等电聚焦电泳程序：250V1h，500V1h，1000V1h，然后在1000V－10000V线性上升5h，10000V恒定8h，电压时间积达80000VH。2双向电泳〔2DE〕84精选课件■第一向电泳〔等点聚焦电泳〕StripsrehydrationIEF350µLrehydrationbuffercontainingofproteinsamples150µg

foreachstripe250V1h,500V1h,1000V1h,linearrampto8000Vover1h,then8000Vconstantforatotalof80000Vh.18-20h85精选课件第一向电泳后，IPGstrips置复原缓冲液中平衡15min，然后在烷基化缓冲液中平衡15min。复原缓冲液：烷基化缓冲液：50mMTris-HCl，pH8.850mMTris-HCl，pH8.86Murea,6Murea,4%w/vSDS4%w/vSDS65mMDTT53mMIodoacetamide〔碘乙酰胺〕30%glycerol30%glycerol痕量溴酚蓝痕量溴酚蓝胶条的平衡：86精选课件3凝胶染色SDS-PADE电泳：IPG胶条平衡后，转移至SDS-PADE胶，进行第二向电泳。电泳程序设置为：5mA30min，10mA30min,15mA1h，20mA1h，25mA至结束。3.1硝酸银染色1．固定45%乙醇+5%乙酸20-30min2．水洗2min×2-60min3．敏化0.02%Na2S2O31-2min4．水洗1min×25．染色0.1%AgNO34℃20-40min6．水洗1min×37．显色40μl甲醛+2gNa2CO3100ml一般10min以内8．停显1%乙酸〔不可用于质谱分析〕EDTA-Na2终止反响(3.65g/250mlddH2O)87精选课件3.2考马斯亮蓝染1固定液〔10%甲醇，7%乙酸〕固定2h2水洗3×10min3胶体兰染色G250〔150－200ml〕3－4h或过夜4用去离子水脱色至背景消失。4图像采集用扫描仪〔AmershamBiosciences,U9909H7L0〕扫描凝胶，采集图像。88精选课件48h感染48h对照银染分析胶图像89精选课件5图像分析用PDQuest软件进行图像分析的主要步骤：◆点的检测〔spotdetection)◆建立匹配组〔machset〕◆建立复制组〔replicategroup〕◆建立分析组〔analysisset〕90精选课件5图像分析91精选课件6表达差异蛋白质点6.1软件分析图像分析显示，各实验组满足T检验〔P<0.05〕，感染后48h表达差异1.5倍以上的蛋白点为：35个点

6.2人工比对对软件分析给出的差异点进行人工校对。92精选课件7.1制备胶条件优化样品蛋白的丙酮沉淀：1按照蛋白样品与预冷丙酮〔含20mmolDTT〕1:3比例参加预冷丙酮溶液2－20℃沉淀2h320000g离心15min，弃上清，倒置于滤纸上4参加原体积1/3裂解液，振荡溶解5超声处理〔超声0.2秒，间隔2秒，15循环，20％功率〕6离心，20000g15min7取上清8定量7差异表达蛋白点的鉴定93精选课件考染制备胶图像感染和对照混合样品1.2mg621感染和对照混合样品0.7mg62794精选课件

丙酮沉淀后对照，700mg720

丙酮沉淀后对照，＞700mg71195精选课件丙酮沉淀后感染>0.7mg730丙酮沉淀后感染0.7mg717上样量不同96精选课件7.2制备胶切胶与胶内酶解1切胶：用解剖刀将目的点切下，并将胶块切成1mm3大小的胶粒，置EP管中。2脱色：参加脱色液100μL浸泡，振荡20min，弃去溶液，重复1-2次洗至透明。3冻干：弃脱色液，将胶粒冻干。4酶解：参加15-20μL酶液〔0.01μg/μL〕，置于4℃放置30min，待酶液完全被吸收，弃多余酶液，补充酶解缓冲液〔25mMNH4HCO3〕15-20μL，使胶完全浸没。37℃保温15小时或过夜。〔注：时间不要太长〕5蛋白提取：吸出酶解液，移至新EP管，原管加提取液Ⅰ〔5%TFA〕100μL，40℃加热水浴45min时，超声3min左右，再水浴45min。吸出提取液与酶解液合并，然后向胶块中参加提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA)100μL，30℃保温1小时，30min时，超声3min左右，吸出提取液与前液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻枯燥。－20℃保存用于质谱鉴定。97精选课件8质谱鉴定样品－基质的准备与点靶：冻干的蛋白样品用0.1%TFA溶解〔一般2.5μL左右〕，然后在靶上点样。①Dried-Droplet法：饱和的基质溶液与蛋白质溶液混合〔5000:1〕，0.5-2μL混合液点到靶体上。②Thin-Layer法：均一的基质层首先在靶体上形成，然后样品加在其上。③先加样品，再加基质。样品点0.8-1μL，可分屡次点样。点完样品后，点基质0.6μL，一次点样即可。98精选课件■全面分析了宿主细胞感染CSFV病毒后蛋白质的整体表达模式。在对照和感染样品中，每块凝胶检测到1300多个蛋白点。在病毒感染后48h，通过软件分析，满足T检验〔P<0.05〕、至少有1.5倍以上的差异表达的蛋白点共有35个。■在显著差异表达的蛋白中，用串联质谱(MALDI-TOFMS/MS)共鉴定了21个蛋白点，其中上调表达蛋白16个，下调表达蛋白5个。根据差异表达蛋白的功能，，根据蛋白功能可以分为细胞骨架、细胞能量代谢、抗氧化应激、核酸复制/转录/翻译、蛋白加工、信号传导以及热休克蛋白等7个类群。9PK-15细胞蛋白质组分析结果99精选课件InfectionInfectioncontrolInfectioncontrolInfectioncontrolAnnexin2GAPDHcontrol

Resultof

Proteomeanalysis(PK-15cells)100精选课件■

感染与复制相关蛋白膜联蛋白annexin2是一个钙依赖的胞质蛋白，能与胞膜结合。参与多种病毒的感染、复制、装配、出芽与释放。比方，annexin2介导巨细胞病毒的感染；在人上皮细胞，annexin2是呼吸道合胞病毒的受体;巨嗜细胞annexin2与HIV1糖蛋白Gag结合，并且annexin2下调表达可显著抑制HIV复制。Annexin2在CSFV感染细胞中上调表达，说明其可能对CSFV感染和复制发挥着一定的作用。

差异表达蛋白的功能意义101精选课件不均一核糖核酸蛋白〔hnRNPs〕是一类核RNA结合蛋白，具有参与转录、mRNA运输与剪接、mRNA稳定性等功能。研究说明一些hnRNPs蛋白参与病毒的RNA合成和加工，比方，hnRNPA1参与丙型肝炎病毒〔HCV〕的复制，调节鼠肝炎病毒RNA合成，几种hnRNPs蛋白还参与人获得性免疫缺陷病毒〔HIV〕的RNA代谢和基因表达的调节。■

感染与复制相关蛋白

差异表达蛋白的功能意义102精选课件■

感染与复制相关蛋白

差异表达蛋白的功能意义翻译延长因子1δ(EF-1δ)在感染样品中显著上调表达。真核翻译延长因子在几种病毒的复制和致病机制中发挥关键的作用。如与WNV、登革热4型病毒、HCV、HIV-1、BVDV等病毒的结构蛋白或非结构蛋白相互作用，促进病毒的复制或抑制宿主细胞的蛋白表达。103精选课件■

细胞凋亡相关蛋白

差异表达蛋白的功能意义糖酵解酶磷酸甘油酸变位酶1〔PGAM1〕上调表达、三磷酸甘油醛脱氢酶〔GAPDH〕下调表达。除了能量代谢功能之外，PGAM的活性增强可抵抗细胞的氧化应激，促进细胞无限增殖；GAPDH是细胞凋亡的通用介导蛋白，与细胞凋亡有关，GAPDH上调表达会诱导细胞的凋亡。抗氧化应激蛋白〔PRDX6,thioredoxin-like〕上调表达,thioredoxin和PRDX6在细胞中过量表达能够抵抗氧化应激，抑制细胞凋亡。以上凋亡相关蛋白的表达变化，抑制了细胞的凋亡，为病毒提供了持续繁殖的场所，实现了持续感染。104精选课件Peptidyl-prolylcis-transisomeraseA(cyclophilinA)playsanimportantroleindenovoproteinfoldingandinisomerizationofnativeproteinsinseveralcellularsystems.Inaddition,cyclophilinAinteractswithHCVRNAaswellastheviralpolymerase,andisanessentialcellularcofactorforHCVreplicationandinfection.46GrowingevidenceindicatesthattheimmunosuppressantcyclosporinA(CsA)-targetedcellularcyclophilincanstronglysuppressthereplicationofHCVinvitroorinvivo.BothHCVandCSFVaremembersoftheFlaviviridae,andhaveasimilargenomestructure;therefore,upregulationofcyclophilinAinCSFV-infectedsamplessuggeststhatcyclophilinAmayalsoplayacriticalroleinCSFVreplication.105精选课件PK-15细胞蛋白质组分析106精选课件CSFV感染猪PBMC蛋白质组分析裂解细胞

二维电泳

CSFV感染猪PBMC

分离外周血白细胞凋亡和T细胞亚群动力学检测107精选课件外周血白细胞凋亡、CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群变化动力学

攻毒后猪外周血白细胞总数显著减少，白细胞凋亡显著高于对照组，CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群急剧下降，说明CSFV感染诱导细胞凋亡是免疫细胞减少和免疫抑制的主要原因。108精选课件

PBMC蛋白质组分析结果感染的PBMC样品中共有73个差异表达蛋白点，质谱鉴定了其中51个蛋白点，属于34种特定蛋白。根据差异表达蛋白的功能可以分为细胞骨架、能量代谢、抗应激蛋白、核酸复制/转录/翻译、蛋白加工等5个功能类群。

109精选课件

PBMC蛋白质组分析结果Westernbloting比较分析cofilin和annexinA1在CSFV感染猪PBMC和对照样品的表达水平110精选课件

PBMC蛋白质组分析结果■细胞骨架紊乱多种细胞骨架蛋白包括肌动蛋白、膜突蛋白、粘着斑蛋白、膜联蛋白A1、踝蛋白等蛋白的表达发生了变化〔上调或下调〕。共有7个不同的蛋白点鉴定为β肌动蛋白或肌动蛋白亚型，4个不同的蛋白点鉴定为膜联蛋白annexinA1。具有不同分子量、等电点的蛋白点被鉴定为同一种蛋白，可能是CSFV感染诱导了宿主细胞骨架蛋白的解聚、降解或不同程度的翻译后修饰，导致细胞骨架的紊乱、崩解。肌动蛋白骨架完整性的丧失与细胞凋亡有着密切的联系。肌动蛋白骨架紊乱能够激活细胞凋亡蛋白酶-3(caspase-3)，进而诱导细胞的凋亡。

111精选课件

PBMC蛋白质组分析结果■感染与复制相关蛋白膜突蛋白是细胞骨架重塑相关信号的转导蛋白，能够调节稳定微管的形成，在感染样品显著上调表达。在HIV-1感染的T细胞系CEM和H9细胞中，膜突蛋白上调表达，与HIV囊膜糖蛋白gp120结合，这种结合可能在病毒的摄入、装配和出芽过程中发挥着重要的作用。与膜辅蛋白CD46相互结合形成麻疹病毒（meslesvirus,MV）的受体复合物，促进细胞对MV的摄入。翻译延长因子1α(EF-1α)在感染样品中显著上调表达，与体外PK-15相似。112精选课件

PBMC蛋白质组分析结果■细胞凋亡相关蛋白粘着斑蛋白参与调节与细胞生存和凋亡有关的细胞信号途径，有研究显示在凋亡细胞中粘着斑蛋白上调表达，而在高度恶化和转移性肿瘤细胞中粘着斑蛋白缺失或显著下调表达。粘着斑蛋白在感染样品中上调表达，显示CSFV诱导了PBMC的凋亡。GAPDH上调表达8倍，而在体外PK-15细胞显著下调表达。抗氧化物酶Prx-1下调表达，Prx-1参与信号调节激酶1（signal-regulatingkinase1,ASK1)信号介导的细胞凋亡途径，并在该凋亡途径中发挥着抑制凋亡的作用。

113精选课件

PBMC蛋白质组分析结果■免疫相关分子血小板反应素1（Thrombospondin1，TSP-1)

，除参与凝血机制外，还具有免疫调节功能，比如，TSP-1调节T细胞行为并参与炎性T细胞的激活和克隆增殖。有证据表明，敲除TSP-1的转基因小鼠对细菌性肺脏感染较敏感，显示了TSP-1对宿主免疫反应的作用。TSP-1显著下调，可能干扰T细胞的免疫功能。抗氧化蛋白的上调表达有助于增强CD8(+)T细胞的抗病毒活性，在HIV感染活化的CD8(+)T细胞中，过氧化物氧化还原蛋白家族成员NKEF-A和NKEF-B上调表达。本研究中，Prx-1显著下调表达，可能会影响CD8(+)T细胞的抗病毒活性。

114精选课件CSFV感染猪血清差异蛋白质组分析2D-DIGECSFV感染猪血清分离

血清标记

去除高丰度蛋白115精选课件

血清差异蛋白质组分析

由于血清/血浆样本易于采集，并且含有细胞和组织分泌的数千种蛋白，血清/血浆中蛋白成分的动力学变化反映着机体细胞、组织的病理生理状态，因此血清/血浆是最有价值的寻找蛋白标记的样品。在人的肿瘤、病毒性疾病的血清蛋白质组研究中发现了一系列的疾病相关蛋白标记，建立了一些新的诊断方法。

116精选课件Cy2(红色)标记混合内标对照样品；Cy3(蓝色)标记感染血清样品；Cy5(绿色)标记对照血清样品。白色的点说明该蛋白在三种样品的含量是相等的，紫色的点说明该蛋白在感染血清中上调表达，绿色的点说明该蛋白在感染血清中下调表达。

血清差异蛋白质组分析结果117精选课件

血清差异蛋白质组分析结果

发现了17个差异表达蛋白点，用质谱鉴定了14个差异表达蛋白。这些差异表达的血清蛋白反映了CSFV感染猪组织、细胞的生理状态的变化，进一步的评价分析将有可能发现与致病机制相关的信息或新型诊断标记。

118精选课件

血清差异蛋白质组分析结果接联球蛋白属于急性期蛋白，可抑制炎性反响造成的损伤。在急性和慢性炎症、病毒感染以及肿瘤等疾病中，血清接联球蛋白的水平会提高。除此之外，接联球蛋白还具有刺激血管生成和组织修复的生物功能。CSFV感染可造成血管内皮系统的损伤，接联球蛋白水平在感染血清中降低，可能不利于炎症损伤的控制和血管内皮系统损伤的修复，进而导致宿主皮下、内脏器官粘膜出血。119精选课件

血清差异蛋白质组分析结果凝血酶抑制因子亚型2的水平显著下调，凝血酶是一个丝氨酸蛋白酶，在凝血级联反响和止血过程中发挥着核心的作用。此外，凝血酶控制内皮组织对损伤的增生、修补反响，促进促炎症反响和促凝血内皮系统反响。在CSFV感染猪的血清中，凝血酶抑制因子亚型2的水平显著下调，可能诱导了凝血机制的紊乱，造成毛细血管弥漫性凝血。120精选课件

血清差异蛋白质组分析结果载脂蛋白AI是高密度脂蛋白的主要载脂蛋白，由肝脏和肠道产生，在胆固醇的逆行转运中具有重要的作用，还具有抗炎症、抗氧化剂、修复人的内皮系统功能障碍的作用。apoAI的水平显著下调，可能不利于炎症反响的控制和血管内皮系统的功能修复。121精选课件

血清差异蛋白质组分析结果与免疫有关的补体C4的亚基C4a、免疫球蛋白γ链两种蛋白在CSFV感染血清中下调表达。补体系统失调与凝血系统的功能障碍等疾病有关。补体成分是炎症反响的重要调节因子，并促进免疫反响的调节C4是补体经典途径的主要成分，感染血清C4a的下调，可能对补体系统的激活和机体的免疫反响以及凝血系统造成不良影响。

差异表达蛋白中的一些蛋白如接联珠蛋白、载脂蛋白AI

及C4a被鉴定为其它疾病的生物标记，这些差异表达蛋白作为CSFV感染生物标记的潜在可能性还需进一步的评估。122精选课件■用2-DE、2DDIGE和质谱鉴定等高通量蛋白质组学技术对CSFV感染蛋白质组进行了系统分析，获得了迄今最为完善的CSFV感染体内外宿主细胞、宿主血清差异表达蛋白质组数据。■鉴定了一些可能的CSFV感染、复制与致病相关宿主蛋白和可能的抑制和诱导宿主细胞凋亡的细胞途径。为CSFV致病机制和新型预防、治疗靶标以及诊断标记的进一步研究奠定了根底，提供了研究素材。

结论123精选课件病毒蛋白质组学研究进展病毒病原生态与分子流行病实验室第三局部124精选课件■

病毒粒子蛋白质组■

病毒感染诱导宿主细胞的蛋白质组变化■

病毒感染宿主血清蛋白质组125精选课件1

病毒粒子蛋白质组研究◆

全面了解病毒粒子的蛋白质组成是研究病毒生物学功能以及特定病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的前提。◆有些病毒粒子中含有非病毒编码的宿主细胞蛋白，这些宿主蛋白反映了病毒在细胞不同的细胞器或细胞亚单位进行复制、装配和释放的可能过程；◆有些病毒粒子中的宿主细胞蛋白，在病毒的生命循环中发挥着重要作用，又非病毒基因组编码，没有突变的压力，可以作为良好的抗病毒治疗候选靶标。如HIV-1病毒粒子中的宿主细胞蛋白CyclophilinA(CypA)，在病毒的复制中发挥着必不可少的作用。

126精选课件病毒粒子蛋白质组分析技术路线127精选课件以痘苗病毒为例，有多个小组用不同方法分析了其蛋白质组成。早在1996年，Jensen等用2DE和MALDI-TOF-MS分析了痘苗病毒的蛋白质组，共鉴定13个病毒编码蛋白，5个细胞蛋白。Chung等〔2006〕用LC/MS/MS技术鉴定了痘苗病毒粒子〔IMV〕包括结构蛋白、酶和转录因子等在内的75个病毒蛋白和23个宿主细胞蛋白，病毒蛋白中有10种蛋白是新发现的病毒蛋白，其中7个蛋白(E6R,G3L,L3L,A6L,A15L,A31R,andC6L)是以前推测的ORFs产物，3个蛋白(K4L,G9R,A16L)的功能和定位是以前所未知的。Yoder等〔2006〕用五种不同组合的方法鉴定了痘苗病毒粒子63个病毒编码蛋白，发现了2个由以前未知的阅读框编码蛋白〔E6R和L3L〕。128精选课件

上述研究用高通量的蛋白质组学方法鉴定了许多以前未知的病毒编码蛋白或未注释的ORFs的产物以及宿主细胞蛋白。由结果可知，不同的蛋白质组方法研究同一种病毒粒子蛋白质组的结果不尽相同，说明不同的方法具有互补性。迄今为止，已报道了包括痘苗病毒、腺病毒、人巨细胞病毒、鼠巨细胞病毒、HIV、SARSCoV等11种病毒的蛋白质组研究。129精选课件病毒成功实现对宿主细胞的感染并在细胞内复制需要克服多重障碍，一方面要克服细胞对病毒感染产生的各种免疫防卫反响；另一方面要阻断或影响宿主细胞的正常循环机制，利用宿主细胞的物质和能量合成病毒自身物质，以实现病毒的复制。因此，病毒感染必然会导致宿主细胞的蛋白质组变化，这种变化又反映了病毒介导的宿主细胞生理功能的变化，反映了病毒的感染及其致病的进程。所以，进行病毒感染宿主细胞蛋白质组的研究是揭示病毒与宿主细胞相互作用机制、发现新的药物靶标和治疗方法的重要手段。2病毒感染诱导宿主细胞的蛋白质组变化130精选课件2.1比较蛋白质组学技术路线131精选课件◆二维差异凝胶电泳〔2Ddifferentialgelelectrophoresis,2DDIGE〕别离技术克服了传统2DE存在的胶与胶之间的差异以及传统的银染等染色方法线性范围窄等缺陷，提高了结果的重复性、准确性，因此，目前应用较多。◆常用的标记定量质谱技术包括体外标记ICAT(isotope-codedaffinitytag)和体内标记SILAC[5](stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture)等技术，ICAT技术是用轻、重两种试剂与蛋白质分子的半胱氨酸残基的－SH基团反响，标记不同蛋白样品。◆SILAC技术主要是在培养细胞的介质中参加用稳定同位素标记的某一种必需氨基酸，在细胞生长过程中掺入标记的氨基酸，实现对不同样品蛋白质的标记。2.2蛋白质组学常用技术的特点比较132精选课件◆这些技术方法各有其优势和局限性，联合使用可实现优势互补。与ICAT相比，SILAC技术省去了标记化学反响和别离纯化等繁琐步骤，但只能用于体外培养细胞，不能用于组织来源的蛋白质样品分析，ICAT那么不能检测没有半胱氨基酸残基的蛋白质分子。◆2DDIGE在检测极端分子量和等电点以及低丰度蛋白方面存在局限性，但具有能够检测翻译后修饰的不同蛋白亚型的优势。；◆ICAT和SILAC两种技术虽在检测低丰度蛋白方面有强大优势，但不能检测蛋白质的翻译后修饰亚型。◆为了简化上述化学标记定量方法的繁琐性和消除因标记效率等因素造成的定量误差，建立了无需样品标记〔label-free〕的液相色谱串联质谱定量蛋白质组新方法，并在实践中陆续得到应用。2.2蛋白质组学常用技术的特点比较133精选课件2.3在蛋白质水平全面揭示宿主细胞的蛋白表达模式

◆Mannová等用2DE、SILAC两种方法分析了HCV感染细胞Huh7的脂筏〔lipidrafts〕蛋白质组变化。两种方法共鉴定了189个差异表达蛋白，这些蛋白大多数与囊泡和蛋白运输以及细胞信号有关。用siRNA抑制上调表达蛋白RhoA、Rab9A、syntaxin7、Bax和Cdc42的表达，分析其对HCV复制的影响。结果显示，抑制Cdc42和RhoA表达会提高HCV的复制，而抑制突触融合蛋白7〔syntaxin7〕的表达会导致HCV复制的降低。抑制Rab9A和Bax的表达，对HCV复制没有影响。134精选课件2.3在蛋白质水平全面揭示宿主细胞的蛋白表达模式

◆Jiang等在SARS冠状病毒〔SARS-CoV〕感染的veroE6细胞系鉴定了186个显著差异表达蛋白。西尼罗河病毒〔WNV〕感染原代神经元细胞，诱导55个蛋白表达水平发生变化，其中的9种鉴定为凋亡相关蛋白。人获得性免疫缺陷病毒1型〔HIV-Ⅰ〕LAI株感染CD4+CEMx174细胞系，在病毒产量顶峰期，有687种蛋白的表达丰度发生变化，这些蛋白多数参与泛素化、核质运输、细胞循环等重要生命循环和代谢通路。135精选课件◆HIV-1的感染可致CD4＋T细胞数量减少，导致免疫缺陷综合征〔AIDS〕。但矛盾的是CD4＋T细胞又是HIV-1病毒的主要繁殖场所，并且有一小局部CD4＋T细胞长期存活，持续生产完整的病毒粒子，这种持续感染机制尚不清楚。◆蛋白质组分析说明，HIV-1Tat蛋白使T细胞的7种细胞骨架蛋白或与细胞骨架重组相关的蛋白下调表达，这些蛋白的下调表达使宿主细胞防止了细胞骨架的重组，保持了细胞的完整，从而抑制了细胞凋亡，使HIV感染细胞成为长期的和持续的病毒粒子生产场所，实现了HIV的持续性感染。2.4.1

HIV病毒持续感染机制

2.4揭示病毒的分子致病机制

136精选课件关于感染野生型狂犬病毒〔RV〕和弱毒RV小鼠的蛋白质组分析显示与离子平衡有关的蛋白H+ATP酶和Na+/K+ATP酶上调表达，而Ca2+ATP酶下调表达，参与突触泡与突出前膜对接或融合的相关蛋白〔alpha-synaptosome-associatedprotein(SNAP),tripartitemotif-containing9(TRIM9),syntaxin,andpallidin〕下调表达，这些蛋白的下调表达，可能导致了神经机能障碍。另外，致弱的RV感染介导凋亡相关蛋白的上调表达，这些数据解释了为什么仅仅在弱毒RV感染的细胞或动物才能观察到细胞凋亡的现象。2.4.2

Rabiesvirus致病机制

137精选课件目前已报道了包括HIV、SARSCoV、EB病毒、柯萨奇病毒(CVB3)、西尼罗河病毒〔WNV〕等10余种病毒诱导宿主细胞蛋白质组变化的研究结果。有必要指出，蛋白质功能数据库还很不完善，限制了对差异表达蛋白的功能注释。因此，仅仅依靠比较蛋白质组学方法鉴定的差异表达蛋白完全说明病毒的致病机制是不现实的，在蛋白质组研究获得的大量信息根底上，还需结合其它技术方法进一步研究差异表达蛋白在病毒感染和致病机制中的具体作用。138精选课件2.5发现病毒的作用靶标

通过病毒感染亚细胞蛋白质组研究，可以发现病毒作用于细胞的靶标蛋白。卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的K5蛋白，是病毒的免疫识别调节子，能够介导多种跨膜蛋白的下调或降解，并能够通过下调MHCⅠ等免