树突状细胞与淋巴细胞的免疫调节

树突状细胞与淋巴细胞的免疫调节

树突状细胞（cd）不仅是已知的唯一能够激活早期t淋巴细胞的原生动物提供子，也是已知的最强抗生素（apc），它对抗生素的提取能力比mcclovac更有效。经抗原刺激的DC回输到体内后,能够迁移到淋巴结,释放多种细胞因子,同时激活T淋巴细胞的分化和分裂,产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL),这些细胞因子和特异性CTL能够有效地促进或直接杀伤表达该抗原的细胞。基于这个原理,利用HIV-1抗原刺激DC所诱导的免疫对HIV-1感染进行免疫预防和治疗的研究已取得初步进展;将高效抗逆转录病毒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy,HARRT)和DC免疫治疗相结合的方案也已成为治疗AIDS的较好方法之一。本文中将对近年来DC在抗HIV-1感染免疫预防与免疫治疗中的应用研究进展作一综述。1DC在抗HIV-1感染非人灵长类动物模型中的免疫预防功能1.1多肽刺激DC诱导的免疫预防功能非人灵长类动物是研究AIDS发病机制、评价免疫预防和免疫治疗效果以及抗HIV-1药物疗效的重要动物模型。含有SIV包膜蛋白8个短肽的“鸡尾酒”刺激DC并经TNF-α诱导成熟后,分别在0、4、8周静脉回输到恒河猴体内或者将“混合肽鸡尾酒”和福氏不完全佐剂(incompletefreund’sadjuvant,IFA)混合直接经皮下免疫恒河猴,可以诱导肽特异的细胞免疫反应,将恒河猴的CD8+T细胞与经肽刺激的DC共培养,分泌IFN-γ的细胞比率最高达约0.5%和0.8%,但是两种免疫方法都没有产生中和抗体。在第25周用100个MID50的SHIV-189.6p静脉攻毒后发现对照组(8只)、IFA/肽免疫组(8只)和肽/DC免疫组(6只)恒河猴都被感染,血浆病毒载量(PVL,plasmaviralloads)在攻毒后第2周达到高峰。攻毒后第10周,3组恒河猴PVL均明显下降而以肽/DC免疫组的PVL下降最为明显;感染病毒后对照组有4只恒河CD4+T细胞下降88%,并出现AIDS症状,对照组8只最终有5只出现AIDS症状;肽/IFA免疫组恒河猴共有6只出现AIDS临床症状;而肽/DC免疫组仅有1只在第10周CD4+T细胞降至60个/μL,并逐渐进展为AIDS。所以肽/DC免疫使恒河猴获得较强的保护,这种保护作用主要来自CD8+T细胞介导的细胞免疫。1.2利用病毒载体表达HIV-1蛋白刺激DC的免疫预防功能腺病毒载体疫苗已被批准用于临床,但宿主产生的载体特异性抗体却限制了腺病毒载体疫苗在同一个体上多次使用。利用表达抗原基因的重组腺病毒感染DC,通过DC回输诱导外源抗原特异性免疫可以避免这一缺点。表达SIV基因的重组腺病毒感染DC并多次免疫恒河猴虽然诱导产生了较弱的载体特异性的中和抗体,但其不足以导致感染DC的清除。即便如此亦应减少中和抗体,由于中和抗体可能因较高的重组腺病毒感染复数所致,故较小的感染复数可以减少之;重组腺病毒载体在恒河猴DC内有效表达SIV的gag基因,恒河猴DC可以将gag蛋白加工并提呈到MHC分子上,诱导特定淋巴细胞(主要是CD8+T细胞)分泌IFN-γ以及其他gag特异的细胞免疫反应;不仅如此,用表达gag蛋白的DC免疫恒河猴可以不必预先检测其MHC分子类型,DC内表达gag蛋白的加工方式可能与SIV感染DC对gag蛋白的加工不同,能够产生新的抗原表位,这对控制病毒突变株感染具有重要意义。1.3不同DC回输方法的免疫预防功能经抗原刺激的DC回输到动物体内有多种方式,但哪一种方式更能有效诱导免疫反应仍是一个值得探讨的问题。有报道称皮下注射的DC可以选择性地归巢到外周淋巴结,但却有较多的DC仍然留在皮下注射部位。静脉注射DC导致DC在肺、肝脏和脾脏内的积聚,所以有人认为经淋巴管或淋巴结回输DC是一种较理想的方式。但表达SIVgag基因的DC经淋巴结回输到恒河猴体内诱导产生分泌IFN-γ的T细胞数量并不比同样条件下经皮下回输所能诱导产生的更多,所以经皮下和淋巴结回输负载抗原的DC可能在诱导T细胞免疫方面具有同样的功能,这是因为DC具有很强的抗原提呈能力,经皮下回输少部分归巢的DC足可诱导相当数量的T细胞反应。但是病毒感染与癌症不同,虽然SIV急性感染恒河猴的DC仍可以回到淋巴结,但在AIDS期,淋巴结趋化因子表达的改变阻碍了这一DC归巢,所以HIV-1感染早期进行免疫治疗的DC通过皮下回输不仅较为方便且能同样产生相应免疫效果,但是对AIDS患者进行免疫治疗也许只有通过淋巴结回输才能取得较好效果。1.4免疫佐剂在DC诱导免疫反应中的应用富含CpG的寡核苷酸序列可以通过TLR(tolllikerecepor)激活DC。CpG寡核苷酸序列的不同,其激活功能也不同。CpG-C活化恒河猴DC后可使其分泌IFN-α和IL-12,这对抗HIV-1感染十分有益。IFN-α除了具有直接的抗病毒作用和激活mDC(myeloidDC)外,还能保护抗原特异性T细胞不因抗原诱导而凋亡,同时抑制B细胞的凋亡;所分泌的IL-12对HIV-1的复制亦有抑制作用(HIV-1感染不诱导产生IL-12),这也许是其逃避免疫攻击的一个途径。在动物实验中,CpG-C可以增加DC的数量,增强恒河猴DC对AT-2灭活SIV抗原的提呈,诱导较强的SIV特异T细胞反应。Flt和G-CSF配体可以增加人、恒河猴外周血中DC的数量。有报道称Flt-3配体可以增强小鼠对可溶性抗原的免疫反应,但在诱导恒河猴抗SHIV89.6p的免疫试验中,一个嵌合的人Flt-3和G-CSF配体类似物ProGP(progenipoietins)虽然显著提高了DC的数量,对DC携带抗原的免疫作用却没有增强。SHIV89.6p攻毒后,所有动物都被感染,实验组和对照组恒河猴的CD4+T细胞数量和PVL没有明显差异。2DC在HIV-1感染非人灵长类动物模型中的免疫治疗效果2.1抗原刺激DC对SIV感染恒河猴的免疫治疗效果从SIV感染恒河猴的外周血中分离培养的DC可以在体外用来刺激产生特异的CTL,以及利用DC在恒河猴体内诱导SIV/SHIV特异免疫反应的实验结果促使人们进一步研究利用DC对SIV感染进行免疫治疗的可能。2003年,Lu等从SIV感染且PVL达108~109拷贝/L的恒河猴体内成功分离培养DC,经过AT-2灭活SIVmac251的刺激后用TNF-α进一步刺激成熟,然后回输到10只恒河猴体内(4次,1/2周),4只恒河猴回输没有经过抗原刺激的同源DC作为对照。首次免疫治疗后10d,实验组恒河猴PVL和细胞内病毒DNA都有明显下降,免疫后第6周,PVL和细胞内病毒DNA数量分别下降至为原来的1‰和2%,并且在整个实验期均保持这一水平(300d),PVL的下降和AT-2灭活SIV刺激DC所引起的免疫反应强度紧密相关。3次免疫后SIV特异的记忆性T细胞(SMTC)升高了36倍,中和抗体也在第3周开始明显增强,在第22周增加到免疫时的8倍,并且在第42周仍然保持7倍水平。抗原刺激的DC所能诱导的免疫反应受到PVL的明显影响,3只PVL大于1×106拷贝/L的动物与7只小于1×106拷贝/mL的恒河猴相比,中和抗体和SMTC明显较低;SMTC对SIV超感染的同源CD4+T细胞内病毒复制的抑制也表明,前者的SMTC具有较低的CTL和抗病毒活性。10只免疫治疗恒河猴的CD4+T细胞从第13周开始都明显增加,但没有因PVL的不同而出现明显差异。2.2修饰DNA疫苗刺激DC的免疫治疗效果DNA疫苗可以有效表达HIV-1抗原并诱导HIV-1特异的免疫反应。在慢性HIV-1感染者体内,HIV-1基因在很多器官内表达,每毫升外周血可有几千个或者更多的病毒颗粒,所以抗原的量不是不能诱导具有保护作用免疫反应的重要因素,而提高APC的加工和提呈能力,是诱导抗病毒感染免疫反应的第一步。为了提高对DNA疫苗所表达抗原的提呈能力,DermaVir疫苗在DNA疫苗的基础上作了进一步改进,它由3部分组成:表达抗原蛋白的质粒、PEIm(polyethylenimine-mannose)、葡萄糖溶液。PEIm不仅形成颗粒性物质,使DermaVir可以在皮下注射后容易被郎罕氏细胞(langerhanscells,LC)吞噬,而且有助于破碎内吞小体,使质粒DNA进入细胞核,表达抗原基因;葡萄糖溶液可以使DermaVir在免疫注射前不发生聚合。为了有效诱导抗HIV-1/SIV免疫反应,DermaVir疫苗DNA一般携带有除HIV-1整合酶以外的所有基因并在HIV-1TLR启动下表达这些基因,在DC内这些抗原蛋白被加工提呈,由此诱导各表位特异的杀伤性T细胞。表皮是机体和外界的一个生理屏障,表皮内含有大量的LC,它们可以接受抗原刺激,然后迁移到外周淋巴结,同时分化成DC,将加工过的抗原提呈给T细胞,诱导抗原特异的免疫反应。实验证明HIV-1/SIVDermaVir疫苗通过表皮LC可在非人灵长类动物中诱导产生HIV-1/SIV特异的免疫反应。在利用DermaVir疫苗进行免疫治疗的实验中,表达SHIV抗原蛋白的DermaVir诱导的免疫反应明显降低SIV感染恒河猴的PVL。DermaVir免疫治疗与HARRT治疗相结合可以更有效地控制PVL反弹,但DermaVir免疫治疗并不能代替HARRT治疗。3DC在抗HIV-1感染临床免疫治疗中的应用效果在动物实验上取得的积极成果促使相关的临床研究逐步展开。初步的体内外实验结果显示,利用抗原刺激的DC能够诱导HIV-1特异免疫反应,降底PVL并减少HIV-1感染的淋巴细胞。3.1抗原刺激DC体外诱导免疫反应对HIV-1复制的抑制在体外的实验研究中,经灭活的自身HIV-1分离株刺激并在体外诱导成熟后,DC甚至可以在1∶100的比例下刺激同源PBL的分裂。刺激后的PBL具有HIV-1特异的CTL活性,可以在10∶1的比例下杀伤表达gag蛋白的靶细胞,而且DC的这种功能没有因不同患者的CD4+T细胞数量和PVL以及是否经过HARRT治疗而出现明显不同。值得重视的是经这种方法激活的T细胞在1∶1的情况下可以杀伤自身HIV-1分离株超感染的PBMC,使其培养上清中的PVL下降为原量的万分之一,HIV-1前病毒DNA的量也能明显降低。如果将效应细胞与靶细胞比例升至5∶1,PVL和前病毒DNA的量可降至检测水平以下。另外,有研究显示HIV-1蛋白酶抑制剂(PI)无论在体内还是体外都能促进患者T细胞的分裂,同时能够抑制其凋亡。不仅如此,PI在自身具有抗病毒活性所需浓度下能够提高DC的抗原提呈功能(诱导CTL及其抗病毒活性)。所以无论是利用抗原刺激的DC进行免疫预防或是免疫治疗,PI可能是一种有效的免疫佐剂。3.2抗原刺激DC对HIV-1感染者的免疫治疗效果利用HIV-1抗原刺激的DC进行AIDS患者免疫治疗的研究也取得一定进展。18名在免疫治疗前1年没有接受HARRT治疗的感染者(PVL>107/L,CD4+T细胞>300个/μL)接受3次经AT-2灭活HIV-1刺激的DC注射(间隔2周,3×107/次),虽然总抗体滴度及中和抗体没有增加,但表达IL-2和IFN-γ的CD4+T细胞以及gag特导的CD8+T细胞和表达穿孔素的CD8+T细胞都明显增强,而且18名患者PVL平均下降80%,且一直保持这一稳定状态直到免疫后360d,前病毒DNA平均下降50%(在第357天有不明显上升)。统计分析表明,PVL的变化与HIV-1特异的分泌IL-2和IFN-γ的CD4+T细胞以及gag特异的表达穿孔素的CD8+T细胞紧密相关,而与gag特异的CD8+T细胞和分泌IFN-γCD8+T细胞没有明显的相关性。在对12名正在进行HARRT治疗PVL已降至2×104拷贝/L的患者进行免疫治疗的研究中,经热灭活HIV-1刺激的DC5次皮下注射后(2×106DC/次,间隔6周),除淋巴组织内总CTL水平有明显增强外,没有检测到明显的治疗效果。两个临床免疫治疗的研究都显示利用抗原刺激的DC进行免疫治疗是安全的,没有局部或系统副作用和自身免疫症状产生,仅有个别患者出现淋巴结增大和轻度流感样反应。5结语采用合适的方法诱导HIV-1特异性的细胞免疫,结合HAART治疗,有可能长期控制HIV-1的感染,减小HARRT治疗的毒副作用和耐药病毒株的出现。利用抗原刺激的DC对HIV-1感染进行免疫预防和免疫治疗可以产生较强的细胞免疫反应,控制PVL和有效杀伤HIV-1感染的细胞。但是如同抗HIV-1疫苗的研究一样,理想的结果可能仅仅出现在对动物模型的研究中。如果能够解决以下问题