激光眼损伤模型研究进展

激光眼损伤模型研究进展

目前，激光在军事、医学、工业、科学研究、娱乐和其他领域得到了广泛应用。眼是机体中对激光最为敏感、最易受损伤的靶器官,激光意外损伤事故以及因治疗需要而造成的眼损伤病例不断出现。因而,建立眼损伤动物模型探究激光致眼损伤机制,研究损伤后治疗方法成为激光及眼科研究的重要问题之一。激光眼损伤病例调查及激光眼效应研究表明,激光致眼损伤的部位主要为角膜及眼底视网膜,激光参数的不同会对损伤部位和程度造成很大影响。本文对常见角膜和视网膜激光损伤动物模型研究进行综述。1覆盖不同波长的前线嘴唇在各种相干上的吸收角膜是人眼球最前面的一层弧形薄膜,面积占眼球前部1/6,直径约为11mm,是眼屈光的重要组成部分,其屈光力占整个眼屈光的3/4。角膜对于波长短于280nm的远紫外线吸收率接近100%,但随波长增加,吸收率减少;对可见光及近红外线大部分透过,对1400～1900nm的中红外线则部分吸收;对1900nm以上的中红外和远红外线角膜是全吸收体。因而,角膜易受紫外及中远红外激光损伤,建立损伤模型常用紫外193nm准分子激光,远红外CO2激光。1.1建立动物模型的必要性紫外激光在临床上可用于消融角膜基质,从而改变眼屈光度。1983年Trokel等利用这一特性,提出193nm准分子激光角膜切削术(PRK)治疗屈光不正,并获成功,然而术后角膜雾状混浊的出现难以解决。为降低雾状混浊而出现的准分子激光上皮下角膜磨镶术(LASEK)是保留了角膜上皮的PRK手术,但术后雾状混浊仍然会发生。角膜雾状混浊会造成患者视力障碍,因而非常有必要建立动物模型去研究其发生机制,探索预防和治疗的方法。兔眼角膜与人较类似,建立模型时多被使用。Chang等建立模型的方法为:实验动物麻醉状态下对角膜中心区域的80%,使用刮除术去除角膜上皮;对角膜中心5mm区域行准分子激光照射,激光能量密度为180mJ/cm2,切削深度60μm;术后定期用裂隙灯观察雾状混浊是否出现,发现该参数下角膜轻度及以上混浊出现率在75%以上,但较重程度的混浊出现率仅为60%左右。康凤英等在切削深度82.5μm,照射区域6mm时的建模结果显示该条件下角膜雾状混浊出现率为80%左右,与Chang等较接近,但其混浊更趋向于较重程度。Rocha等采用的切削深度分别为90μm及100μm,区域为6mm;Wang等的切削深度为120μm,区域为6mm。以上实验角膜雾状混浊出现率都较高,接近100%,且角膜混浊程度重。由于切削区域6mm的PRK术后角膜雾状混浊的出现率较高,因而该种切削区域较适合用于模型的建立,切削深度在80～120μm均能取得较高成功率。Mohan等尝试用小鼠构建该模型,采用在照射脉冲数达到设定值一半时加筛目使角膜上光分布不均的方法,成功地诱发了雾状混浊出现。1.2激光对兔眼角膜损伤的影响中远红外激光照射角膜时,几乎完全被角膜吸收,造成角膜烧伤。角膜损伤轻者出现白色或灰白色凝固斑,这种损伤是可逆的,愈后不留瘢痕;损伤较重者,可累及角膜基质深层,愈后留瘢痕,遮挡瞳孔时影响视力;重度损伤者可造成角膜穿孔,引起失明。CO2激光是出现较早,研究与应用也较多的一种远红外激光,造成角膜烧伤也较常见,因而,应用其建立角膜烧伤模型也较普遍。Fine等于1967年首先对CO2激光兔眼角膜作用进行了研究,激光功率密度为15W/cm2时,持续时间1s即可造成较强的白色凝固斑,损伤仅限于角膜上皮。Takata等对猴眼角膜CO2激光损伤阈值的研究发现,在光斑直径3.54mm,持续时间为1s、100ms时损伤阈值分别为3.8W/cm2和12.1W/cm2,所出现的损伤均为角膜,刚可见凝固斑。陈华等用CO2激光建立不同程度的兔眼角膜瘢痕模型,其实验方法为:实验动物麻醉后,立即以CO2激光垂直照射角膜中央,光斑直径5mm,动物每天2次氯霉素滴眼,观察持续2个月。结果表明,在照射时间1s,功率密度127W/cm2时,最终60%角膜出现穿孔,40%角膜出现瘢痕,瘢痕直径6.8mm左右,个别的有血管增生,瘢痕深达角膜全层。照射时间1s,功率密度102W/cm2时,30d后全部角膜均出现瘢痕,瘢痕直径6.4mm左右;相同功率密度照射0.5s时,20d后全部出现瘢痕,瘢痕直径5.7mm左右。功率密度62W/cm2,时间0.5s,16d后全部出现瘢痕,瘢痕直径5.3mm左右。他们认为建立角膜瘢痕模型较合适的激光参数为能量密度30～100J/cm2,瘢痕形成时间为照后15～30d。并且认为建立角膜损伤模型时,激光照射前角膜的暴露情况不同会造成角膜表面水含量不同,从而影响角膜损伤程度。CO2激光由于角膜穿透能力差,损伤较轻时往往仅累及角膜浅层。与此明显不同的是,具有“体吸收”特点的近红外激光,如波长1315nm化学氧碘激光、波长1318nmNd∶YAG激光等由于组织穿透能力强,造成的角膜损伤往往贯穿角膜全层,因而可用于建立角膜全层损伤模型。Ketzenberger等使用1318nmNd∶YAG激光在脉冲宽度0.5ms、光斑直径0.1mm条件时照射兔角膜,角膜损伤阈值为382J/cm2;Zuclich等使用功率2W连续1318nmNd∶YAG激光,光斑直径1mm,照射兔角膜时损伤阈值为175J/cm2,并且发现能量密度升高到260J/cm2时有白内障现象出现。杨在富采用固定照射功率1.68W,光斑直径2mm,以不同剂量的激光照射家兔角膜发现该条件下角膜损伤阈值为53.5J/cm2。这些眼损伤效应结果可为建立损伤模型提供参考。2wolfe的视网膜损伤病例分析由于中远紫外线及远红外线已被角膜及晶状体吸收,只有近紫外线、可见光和近红外线能到达眼底,造成视网膜的损伤,按其损伤效应可以分为光化学损伤、热损伤以及机械损伤。视网膜光化学损伤易发生于低功率、长时间蓝紫激光照射条件下,由于需要作用时间较长,临床及意外事故中不常见;热损伤及机械损伤在激光视网膜损伤事故中发生率较高。Wolfe对激光视网膜损伤病例进行分析,认为视网膜损伤可分为4个等级:视网膜水肿、视网膜凝固坏死、视网膜下或视网膜内出血以及玻璃体出血或视网膜全层击穿。他发现20%患者为视网膜凝固坏死损伤,70%患者出现了视网膜出血或视网膜击穿、玻璃体出血损伤,严重影响患者视力。临床治疗视网膜脱落等眼底疾病时常用经瞳孔视网膜光凝法,在完成眼底疾病治疗的同时,也会不可避免地造成视网膜组织损伤。2.1ndyg激光与br多通道视网膜模型的对比研究激光视网膜热损伤轻者仅是视感受器层和色素上皮层轻度水肿,可自愈且不留瘢痕;重者则视网膜出现明显灰白或瓷白色凝固斑,组织学改变累及视网膜全层,出现色素上皮层肿胀、破裂,视感受器崩解,神经节细胞水肿或变性,神经纤维层破坏等,这类损伤愈后会出现色素沉着或形成瘢痕。波长较短的蓝绿光主要影响色素上皮层、视感受器细胞层和内外核层,可引起色素上皮层肿胀、破裂,破坏视感受器细胞,内外核层细胞核固缩等损伤。Rosner等在研究神经保护剂对激光视网膜损伤治疗作用时,选用同系繁殖的雄性色素DA大鼠作为实验动物(认为其眼底色素分布均匀且个体差异较小),使用514nm氩激光建立模型,光凝参数为功率100mW、脉冲宽度0.05s、光斑直径200μm,每只眼照射6点,位于视盘附近上下各半,距视盘两倍视盘直径,观察损伤情况,发现损伤部位包括视网膜外核层、色素上皮层及脉络膜浅层,病灶局限于照射部位。照射后3d即出现外核层细胞大量减少,色素上皮层处出现梭状空腔;照射后20d,受照区视网膜外核层及神经纤维层向内膨突形成丘形隆起;照射后60d,色素上皮层处空腔扩大,形成瘢痕。Zwick等同样使用514nm氩激光建立模型,但其使用的实验动物为乌梢蛇,该动物的突出优点是可对视网膜感光细胞进行在体观察,发现在功率50mW、脉冲宽度0.01s激光光凝时,30～60s后损伤区视感受器层即出现轻微肿胀,10min后肿胀扩大,1h后视网膜出现白色凝固斑。该模型为研究光凝后视网膜的即时反应提供了基础。532nm倍频Nd∶YAG激光在眼科的应用日益广泛,其波长与氩绿激光接近。Campos等应用532nm倍频激光光凝大鼠视网膜造成损伤,脉冲宽度0.1s,光斑直径50μm,功率为80～90mW,发现光凝处色素上皮肿胀、断裂,视网膜各层细胞向内隆起,结构混乱,Bruch膜击穿。蔡克波等使用光斑直径200μm,脉冲宽度0.1s,功率50～350mW的532nm倍频激光光凝兔视网膜,发现低剂量时仅表现为光感受器细胞层轻微肿胀,高剂量时表现为视网膜内、外核层损伤,神经节细胞和神经纤维层尚完整,脉络膜见炎性细胞浸润。激光功率进一步提高可造成视网膜全层性的损伤,引起视网膜击穿。付海涛等使用倍频Nd∶YAG激光照射犬视网膜时发现,当光斑直径50μm、脉冲宽度0.1s时,功率为0.9W激光照射12点中有2点可看到有空泡出现;1.2W时照射的12点中,6点视网膜全层(包括Bruch膜)完全被击穿,呈漏斗状缺失,其边缘视网膜结构层次不清,周围细胞反应明显;1.5W时各点视网膜全层(包括Bruch膜)的击穿率为100%,击射点周围的细胞反应明显;1.8W时击穿率也为100%,但视网膜周围组织破坏严重,视网膜的层次结构完全消失,脉络膜毛细血管亦受损,甚至累及巩膜组织,周围组织细胞反应并不明显。上述结果表明,使用倍频Nd∶YAG激光建立击穿犬眼视网膜全层(含Bruch膜)模型的最佳参数为1.2～1.5W、50μm、0.1s。波长较长的红光及近红外线由于主要被血红蛋白、色素上皮层及脉络膜吸收,可用于直接损伤视网膜下脉络膜血管。Cohen等用630nm氪激光光凝小鼠视网膜,光凝参数为功率400mW、脉冲宽度0.05s、光斑直径50μm,为避免照射点间的互相影响,每眼只照射一点,发现该条件下色素上皮层及Bruch膜破裂,光凝后28d,光斑内可见大量新生血管。祃红燕等使用波长647nm氪激光对兔眼视网膜进行光凝,激光功率为380～400mW,曝光时间为0.05s,光斑直径为50μm,得到损伤程度与Cohen等相似。张晖等发现波长810nm的半导体激光光凝兔视网膜,脉冲宽度为0.5s,光斑直径为200μm,当入射功率为200～350mW时光凝即刻视网膜小丘状隆起及灶状粘连,外核层细胞聚集、核深染;光凝后1d,外核层与内核层细胞疏松,可见内核层和神经节细胞层有较大的空泡水肿;光凝后7d,视感受器细胞层与外核层萎缩消失,含有色素的吞噬细胞迁徙至视网膜内层,并可见脉络膜血管扩张、血栓形成和白细胞浸润。2.2qndyg激光与未固定术模型脉冲宽度为纳秒的激光对视网膜的损伤主要为机械损伤。Lee等的研究表明,在脉冲宽度窄于50μs时,损伤从以热效应为主转变为以机械效应为主,可造成色素上皮层击穿、不同程度视网膜下或视网膜内出血及玻璃体出血。激光损伤事故中机械损伤占很大比例,而脉冲宽度纳秒级的调QNd∶YAG激光应用较广、损伤事故中较常见,因而常用于建立机械损伤模型。Brown等对猕猴右眼和左眼分别使用514nm氩激光和1064nm调QNd∶YAG激光照射建立视网膜非出血性损伤模型,激光参数分别为:氩激光功率260mW,脉冲宽度10ms,光斑直径200μm;Nd∶YAG激光脉冲宽度10ns,照射能量1～2mJ。比较不同脉冲宽度建立的模型,他们认为纳秒级脉冲激光作用于视网膜引起的机械损伤较热损伤更显著,主要表现为色素上皮层击穿,视感受器层破坏,两层间出现充满渗出物的间隙。Brandeis等应用脉冲宽度20ns的调Q倍频Nd∶YAG激光照射兔视网膜视乳头附近后极部,发现激光单脉冲照射时,24h后出现视网膜内出血的激光能量阈值为153.3μJ;多脉冲照射时,视网膜下出血阈值为90.88μJ;Gibbons等用同样脉冲宽度调Q倍频Nd∶YAG激光单脉冲照射猴视网膜时发现致其玻璃体出血的能量为156μJ。Blankenstein等用脉冲宽度30ns的调QNd∶YAG激光照射猴眼视网膜黄斑区发现,单脉冲激光能量为1.7mJ时可引起视网膜下出血,能量为2.3mJ时出现玻璃体出血。3视网膜损伤模型的建立总之,要建立理想的激光眼损伤动物模型,应根据研究目的合理地选择实验动物、激光器和照射参数。角膜损伤模型的实验动物一般是兔,因为其获得较易且与人角膜类似;建立角膜雾状混浊模型时准分子激光以切削角膜6mm区域80～120μm深度为宜;建立角膜烧伤模型CO2激光较合适的激光参数为能量密度30～100J/cm2,瘢痕形成时间为照后15～30d。视网膜损伤模型中猴、兔、大鼠、小鼠等实验动物均有应用,乌梢蛇作为实验动物的引入可方便研究者在体观察感光细胞损伤后的变化过程;而不同类型视网膜损伤模型可以通过使用不同激光来获得:建立视网膜热损伤模型可使用可见及近红外激光光凝,而激光视网膜机械损伤模