银杏叶提取物银杏酮酯抗心律失常的药效及机制研究

银杏叶提取物银杏酮酯抗心律失常的药效及机制研究

黄酮类、甘薯、甘草和少量氨基酸。银杏叶包括黄酮类、甘薯、五味子、碱、长链醇、酮和养分。目前国际上常用的银杏叶提取物为德国Schwabe公司在20世纪70年代的专利产品EGb761,其中黄酮类的含量为24%,萜内酯含量为6%。而我国自主研发的银杏酮酯(GBE50)是一种新的银杏叶标准提取物,其成分为总黄酮44%、总内酯6%,因产品工艺的先进性,已取得多国专利。GBE50有着广泛的防治心血管疾病的作用以及临床运用前景,但对GBE50抗心律失常作用及其机制的研究未见报导。心律失常是严重威胁人类健康的心脏疾病,目前药物治疗仍是抗心律失常的主要临床治疗方法。本实验从整体及细胞水平采用多种心律失常模型,通过心电记录分析及心室肌细胞常规微电极记录等方法观察研究银杏叶提取物GBE50抗心律失常的作用并进一步分析其机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物清洁级雄性SD大鼠,体重(270±30)g;雄性豚鼠,体重(230±20)g,上海中医药大学实验动物中心提供。1.1.2区域聚合物的配制含2%丙二醇(PF)生理盐水溶液;银杏酮酯母液:每5mg银杏酮酯溶解于1mL2%丙二醇(PF)溶液中备用,GBE50由杏林药业提供(批号050901);乌头碱(aconitine,Fluka公司,批号402350/1)用生理盐水溶解,配制成50mg·L-1的母液备用,实验中体积稀释至3倍使用;哇巴因(ouabain,Sigma公司,批号057K1625)用生理盐水溶解,配制成1g·L-1的溶液;奎尼丁(Sigma公司,批号108F0776)用生理盐水溶解,配制成1.5625g·L-1的溶液;盐酸地尔硫卓(日本田边制药,批号0602002)用生理盐水溶解,配制成234.375mg·L-1的溶液。1.1.3实验仪器和仪器RM6240C生物信号采集系统(成都仪器厂);ZCZ-50自动抽注机(浙江医科大学医学仪器实验厂);SWF-1W微电极放大器(成都仪器厂);PE-21微电极拉制仪,PF5-1微推进器(日本NARISHIGE公司)。1.2方法1.2.1奎尼丁组与gbe50组的刑罚执行治疗麻醉大鼠用20%乌拉坦按5mL·kg-1腹腔注射,仰卧固定,颈静脉插管备用。对照组经颈静脉注射含2%丙二醇(PF)生理盐水溶液(6.4mL·kg-1);奎尼丁组经颈静脉注射奎尼丁溶液0.01mg·g-1;GBE50组注射不同剂量的GBE50液(8,16,32mg·kg-1)。注射量均为6.4mL·kg-1,2min内注射完,稳定10min后由颈静脉通过自动抽注机恒速注入乌头碱溶液(16.67mg·L-1·min-1),通过RM6240C生物信号采集系统密切观察并记录Ⅱ导联心电图,并准确计算诱发异常心电(室早、室速、室颤、停搏)的乌头碱用药剂量。1.2.2盐酸地尔硫卓组与gbe50组的配制麻醉大鼠用20%乌拉坦按5mL·kg-1腹腔注射,仰卧固定,颈静脉插管备用。对照组经颈静脉注射含2%丙二醇(PF)生理盐水溶液(6.4mL·kg-1);盐酸地尔硫卓组经颈静脉注射盐酸地尔硫卓溶液0.0015mg·g-1;GBE50组注射不同剂量的GBE50液(8,16,32mg·kg-1)。注射剂量均为6.4mL·kg-1,2min内注射完,稳定10min后由颈静脉通过自动抽注机恒速注入哇巴因溶液(1000mg·L-1·min-1),通过RM6240C生物信号采集系统密切观察并记录Ⅱ导联心电图,并准确计算诱发异常心电(室早、室速、室颤、停搏)的哇巴因用药剂量。1.2.3hz检测原理将豚鼠击昏后开胸,迅速取出心脏置于37℃95%O2和5%CO2饱和台氏液中,解剖分离出右侧心室乳头肌用0号不锈钢针固定于恒温[(36±0.5)℃]、恒流(4mL·min-1)的灌流槽中央底部。以铂金丝电极作细胞外刺激。用RM6240C型生理实验系统输出电脉冲刺激,刺激波宽1ms、强度为阈值的1.5～2倍,频率为1.67Hz(BCL=600ms)。以乏极化银丝作为细胞外参考电极,记录电极为玻璃毛细管(直径1.5mm,有芯,型号GG-17,中国科学院上海生理所产品)经微电极拉制仪拉制而成,拉制好的微电极,其内充以3mol·L-1KCl的电极内液,电极电阻为10～20MΩ,并以铂金丝电极引导,采用标准微电极技术,用微推进器将玻璃微电极插入已分离的右心室乳头肌内引出跨膜电位,信号经微电极放大器放大,由RM6240C信号处理系统显示、记录、处理、分析。乳头肌于正常台氏液中持续灌流2～4h,稳定后记录动作电位,待波形稳定30min后,改用含有哇巴因的高钙台氏液灌流标本30min,观察DAD及TA出现的时间及各项指标的变化,并以正常台氏液洗回以验证相应诱发的DAD和TA的重复性,以此作为对照组;维拉帕米组、GBE50高、中、低剂量组:处理同上,待波形稳定30min后,分别改用含有维拉帕米(阳性对照药)以及不同浓度GBE50的哇巴因、高钙台氏液灌流标本30～50min,分别观察、记录DAD及TA出现的时间及各项指标的变化,同样以正常台氏液洗回以验证相应诱发的DAD和TA的重复性。1.3统计学分析所有数据用x¯±sx¯±s表示,实验计数资料均用单因素方差分析以及t检验进行统计学分析,计量资料用精确概率法进行统计分析。资料用RM6240C信号处理软件、微软Excel2003及SPSS11.0软件进行原始图形的采集、数据处理、分析及绘图。2结果2.1头皮碱的诱发对照组大鼠经颈外静脉给乌头碱平均剂量达23.86μg·kg-1时出现室性早搏(VP),剂量达27.21μg·kg-1时发生室速(VT),剂量达34.71μg·kg-1时诱发室颤(VF),当剂量增加至43.40μg·kg-1时则导致心跳停搏(CA)。奎尼丁组(Quin)则使乌头碱诱发的室早、室速、室颤、停搏剂量分别提高至29.55,34.52,39.15,48.68μg·kg-1,诱发的室早、室速剂量与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。8mg·kg-1GBE50使乌头碱诱发室速剂量提高至32.62μg·kg-1;16mg·kg-1GBE50使乌头碱诱发的室颤、停搏剂量分别提高至48.62,57.43μg·kg-1;32mg·kg-1GBE50使乌头碱诱发的室早、室速剂量分别提高至28.06,31.30μg·kg-1,上述数值和对照组比较有明显的升高并具有显著性差异(P<0.05或P<0.01,表1)。结果表明GBE50具有抗乌头碱所致心律失常的作用。2.2两组课外疗效比较对照组大鼠经颈外静脉给哇巴因平均剂量达534.49μg·kg-1时出现室性早搏,剂量达1056.50μg·kg-1时发生室速,剂量达1579.18μg·kg-1时诱发室颤,当剂量增加至1891.09μg·kg-1时则导致心跳停搏。地尔硫卓组(DIL)则使哇巴因诱发的室早、室速、室颤、停搏剂量分别提高至845.24,1341,2099,2404μg·kg-1,与对照组比较具有明显的升高并具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。8,16mg·kg-1GBE50使哇巴因诱发的室早剂量分别提高至755.28,751.72μg·kg-1;16mg·kg-1GBE50使哇巴因诱发的室速剂量提高至1291μg·kg-1,上述数值和对照组比较具有显著性差异(P<0.05);16mg·kg-1GBE50组与地尔硫卓组比较具有显著性差异(P<0.05)。结果显示8,16mg·kg-1银杏酮酯GBE50可明显提高哇巴因所致大鼠心律失常实验中哇巴因诱发的室早、室速、室颤、停搏剂量,但作用较地尔硫卓要弱,而32mg·kg-1GBE50则没有明显的预防作用,表明了GBE50抗心律失常作用在一定浓度范围内有效(表2)。2.3灌流标本获得的反演分析应用标准微电极技术在台氏液中记录到豚鼠心室乳肌头动作电位(AP),稳定30min,改用含有哇巴因(2μmol·L-1)的高钙(CaCl25.4mmol·L-1)台氏液灌流标本,经12.37min左右开始出现DAD,连续灌流30min可以诱发乳头肌产生波形典型、重复性好的DAD,并可以观察到连续性的或非连续性的TA,其发生率为87.5%。同时动作电位波形开始明显改变,表现为RP除极,APA减小,APD缩短,平台期消失。实验结果显示GBE50可以明显抑制哇巴因、高钙诱发的DAD和TA,并呈一定的浓度依赖性(表3,图1)。3实践机制之一:ca2+与银杏酮酯的相互作用乌头碱致心律失常的机制是通过激活心肌细胞的快Na+通道,使Na+通道开放,加速心肌细胞Na+内流,促使细胞膜去极化,加速起搏点的自律性。还能够提高心房传导组织和房室束-浦肯野系统等快反应细胞的自律性,从而形成一源性或多源性异位节律,缩短心肌不应期,导致心律失常。哇巴因是复制心律失常模型经典工具药。哇巴因能与Na+-K+-ATP酶结合并抑制心肌细胞膜上的Na+-K+-ATP酶,从而减少K+向细胞内的主动转运,这样就导致细胞内Na+高K+低,静息膜电位(RMP)增高,心室自律性提高,传导减慢,在浦肯野纤维与心室肌结合部位引起单向传导阻滞而引起折返;另外细胞内高Na+,可通过Na+/Ca2+交换机制使细胞内Ca2+增加,导致振荡性后电位而引起异位节律,诱发快速型心律失常。还有研究表明哇巴因诱发心律失常与缩短动作电位时程(APD)有关,而且实验证实了Ito(瞬时外向钾电流)和IK1均参与了缩短APD的过程,是心律失常的发生机制之一。尚有报道哇巴因的心脏毒性作用与自由基损伤等有关,哇巴因诱发心律失常的机制是多样的,细胞内Ca2+超载只是其中之一。本实验结果表明GBE50对乌头碱及哇巴因致整体动物心律失常模型有着显著性抑制心律失常的作用。作者还从细胞水平探索GBE50抗心律失常的作用。Cranefield从基本电生理学出发把异常起搏活动分为两大类:一类是早期后除极,另一类是延迟后除级。延迟后除极DAD是在心肌动作电位完全复极化后发生的跨膜电位的震荡。跨膜电位震荡达到一定阈值就产生自发反应,被称为触发活动(triggeredactivity,TA)。目前普遍认为DAD诱发的TA可能是某些临床心律失常发生的重要机制。在离体组织上,DAD和DAD诱发的TA常常在细胞内Ca2+浓度明显提高或细胞内钙超载的情况下出现。哇巴因的应用和细胞外高钙最终引起细胞内高钙,就可以激活,而使更多的Ca2+离子从肌浆网中释放出来,最终触发DAD。从DAD发生的离子机制上来讲,DAD是被Iti即短暂内向离子流诱导产生的。如果应用药物抑制Iti就可以抑制DAD的发生。Iti的组成包括一种非选择性阳离子流和一种生电性Na-Ca交换介导的离子流。二者都是继发于Ca2+离子从超载的肌浆网中释放的。在实验中观察到银杏酮酯可以减少DAD的幅度和持续间期以及TA的发生率。银杏酮酯对DAD和TA的这种