地黄寡糖对2型糖尿病大鼠血糖的影响

地黄寡糖对2型糖尿病大鼠血糖的影响

地黄是一种传统的中医，已经在中国用于治疗糖尿病已有几千年的历史。地黄寡糖(Rehmanniaglutinosaoligosaccharide,ROS)是地黄的主要成分之一,具有改善造血、促进免疫、抗肿瘤等作用。我们以往的研究证明ROS无论以腹腔注射或灌胃均可降低四氧嘧啶(ALX)糖尿病大鼠的血糖,对去胸腺大鼠及老年大鼠受损的糖代谢(impairedglucosemetabolism)有改善作用。由于成人糖尿病以2型糖尿病为主(占90%以上),本文主要研究ROS对2型糖尿病大鼠的作用及可能的机制,以期为其进一步应用提供科学数据。1材料和方法1.1实验动物1.2药物、试剂和仪器地黄寡糖(ROS)由兰州军区兰州总医院临床药理基地提供,其中四聚糖占60%,三糖占20%,其余为单糖或二糖。链脲佐菌素(批号:054K0624)和葡萄糖-6-磷酸二钠盐(批号:114K7027)购自Sigma公司;50%葡萄糖注射液(批号:20040601),兰州军区兰州总医院药剂科;盐酸二甲双胍(批号:020413),正安医药(天津)有限公司;盐酸肾上腺素注射液(批号:0404051),天津金耀氨基酸有限公司;血糖检测试剂盒(批号:1204121)、总胆固醇(TC)检测试剂盒(批号:1104101)、甘油三酯(TG)检测试剂盒(批号:1104111)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒(批号:1104091),四川迈克科技责任有限公司;胰岛素放射免疫分析试剂盒(批号:20050420、20050520),北京市北方生物技术研究所;蒽酮(批号:980818),北京金龙化学试剂公司;钼酸铵(批号:20021214),天津化学试剂四厂。1.4大鼠糖代谢或血糖检测♀Wistar大鼠长期高脂肪饲料饲养加小剂量链脲佐菌素诱导大鼠2型糖尿病模型。高脂饲料的配方为:蛋黄2.5%、蔗糖20%、猪油10%、基础饲料67.5%。以上述饲料饲养2～3个月后再以STZ(30mg·kg-1,ip)诱发糖尿病,STZ注射前大鼠禁食16h。注射后3～7d检测血糖值,血糖值大于14mmol·L-1者纳入实验。实验动物分为正常对照组、2型糖尿病模型组、ROS给药组(100、200mg·kg-1·d-1)及二甲双胍给药组(200mg·kg-1·d-1)。正常对照组及2型糖尿病模型组给予等量生理盐水,均为灌胃给药,给药22d后断头处死。选用♂Wistar大鼠,分为正常对照组、高血糖模型组、ROS给药组(200mg·kg-1·d-1)及二甲双胍给药组(200mg·kg-1·d-1)。正常对照组及高血糖模型组给予等量生理盐水,均为灌胃给药。给药6d后分别采用葡萄糖(2.5g·kg-1,ip)和盐酸肾上腺素(300μg·kg-1,ip)诱导正常大鼠葡萄糖和肾上腺素性高血糖模型。实验期间2型糖尿病模型于末次给药后禁食6～7h,乙醚麻醉,眼球后静脉丛采血。0.1mol·L-1EDTA抗凝,立即离心并分离血浆用于测定;实验结束时大鼠断头处死收集全部血液,立即离心并分离血浆用于测定或存于-70℃。对正常大鼠葡萄糖或肾上腺素性高血糖模型,给药6d后于腹腔注射葡萄糖或肾上腺素前(0min)和注射30、60、120min后分别乙醚麻醉,眼球后静脉丛采血。取禁食后血液,分离血浆,用GOD-PAP法测定。具体操作参见试剂盒说明书。结果以mmol·L-1表示。2型糖尿病实验大鼠断头处死后采血,收集血浆进行测定。血浆总胆固醇(TC)用COD-CE-PAP法测定,甘油三酯(TG)用GPO-PAP法测定,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)用PTA-Mg2+沉淀法测定。具体操作参见试剂盒说明书。结果以mmol·L-1表示。用放射免疫法进行测定,具体操作参见试剂盒说明书。结果以μIU·ml-1表示。1.4.7葡萄糖-6-磷酸酶活性的测定据文献方法略加修改。肝组织以5倍体积0.25mol·L-1蔗糖制成匀浆,粗匀浆于高速离心机上11000×g,4℃离心30min,上清液用于酶活性测定。酶反应体系包括0.25mol·L-1蔗糖/1mmol·L-1EDTA(pH7.0),0.1mol·L-1葡萄糖-6-磷酸二钠盐,0.1mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液(pH6.5),总体积0.3ml,将适量待测上清液加入反应体系开始反应,37℃孵育5min。反应终止时加入10%三氯乙酸2ml,冰浴冷却,3000×g离心10min去除沉淀,再取0.5ml上清液测定无机磷含量(钼酸铵法),根据酶活性单位定义计算葡萄糖-6-磷酸酶活性。酶活性单位定义:100ml酶上清液在37℃,5min水解产生1mg无机磷为1个酶活性单位(IU)。各组实验数据用x¯±sx¯±s表示,组间差异的显著性用t检验方法进行统计学处理。2结果2.1ros对小鼠血糖值的影响如Tab1所示,2型糖尿病模型组大鼠在整个实验过程中血糖值都明显高于正常对照组,并且上升69.25%。与2型糖尿病模型组相比,ROS低剂量组(100mg·kg-1·d-1)d11血糖值下降10.78%,ROS高剂量组(200mg·kg-1·d-1)d11血糖值下降21.35%,但差别无统计学意义;ROS低剂量组d22血糖值下降18.35%,ROS高剂量组d22血糖值下降36.15%(P<0.01);二甲双胍组d11血糖值下降14.18%,d22血糖值下降20.49%,但统计学处理差异无显著性。2.2型糖尿病模型ros对hdl-c的影响如Tab2所示,与正常对照组相比,2型糖尿病模型组d22TC、TG明显升高(P<0.01),HDL-C明显降低(P<0.01)。与2型糖尿病模型组比较,ROS低剂量组d22TC、TG分别下降了16.32%和34.97%,高剂量组分别下降了15.79%和27.87%,下降趋势与剂量关系不大。同时,与2型糖尿模型组比较,ROS低、高剂量组HDL-C水平均有增高(P分别<0.05和<0.01),分别上升了44.83%和43.10%。而阳性对照二甲双胍组d22TC降低了22.63%,TG上升了8.20%,HDL-C上升了22.41%。2.3ros对d32肝糖原的影响如Tab3所示,2型糖尿病模型组大鼠肝糖原含量明显低于正常对照组。ROS高剂量组d22肝糖原与2型糖尿病模型组相比增加了46.84%,但统计学处理差异无显著性。ROS低剂量组和二甲双胍组d22肝糖原含量与2型糖尿病模型组相比差别不大。2.4最大限度是利用过程中,p在0.1.1的基础上测定,提出并证明了,领导力量即如Tab4所示,2型糖尿病模型组与正常对照组相比,G-6-Pase的活性升高(75.93%,P<0.01)。ROS低剂量组d22与2型糖尿病模型组相比,G-6-Pase的活性降低了14.19%,而ROS高剂量组降低了24.58%(P<0.01),呈一定的剂量依赖性。二甲双胍组亦有类似作用,与2型糖尿病模型组相比降低了17.90%(P<0.05)。2.5大鼠输注后d32胰岛素含量在进一步的实验中我们研究了ROS对2型糖尿病大鼠血浆胰岛素含量的影响,如Tab5所示,各组2型糖尿病大鼠d0与正常大鼠相比胰岛素含量相当,d22断头处死大鼠进行胰岛素检测,与2型糖尿病模型组比较,ROS低剂量组d22胰岛素含量上升了43.95%,ROS高剂量组d22胰岛素含量上升了54.99%,而二甲双胍组d22胰岛素含量上升了19.31%,但差异均无显著性(P>0.05)。2.6血糖峰值的变化如Tab6所示,对于肾上腺素性高血糖模型组,ROS(200mg·kg-1·d-1)给药6d可降低血糖峰值,其中第120min的血糖值降低了26.33%,差异具有显著性(P<0.05),二甲双胍组降低了43.81%(P<0.01)。对葡萄糖性高血糖模型,ROS给药6d后,也对血糖峰值有降低趋势,第30min的血糖值降低10.73%,二甲双胍组降低了8.37%,但与模型组相比较差异均无显著性。3ros在2型糖尿病模型上的降血糖作用地黄作为治疗糖尿病的四大“圣药”之一,在中国用于治疗糖尿病已有数千年历史,而成年人糖尿病患者中又以2型糖尿病为主。2型糖尿病主要表现为胰岛素抵抗为特征的葡萄糖代谢紊乱,同时伴有脂代谢紊乱,表现为血浆中TC、TG含量增多,HDL-C含量降低,表明葡萄糖稳态(glucosehomeostasis)失调。本文在我们以往研究的基础上进一步观察ROS对2型糖尿病大鼠血糖的影响及其机制。实验结果表明,用长期高脂饲料喂养及小剂量STZ注射可以成功诱发2型糖尿病模型,表现为血糖逐渐增高伴有TC和TG升高,HDL-C降低。ROS在2型糖尿病大鼠模型上灌胃给药22d后能有效抑制血糖的上升趋势,降低血糖水平,尤其是ROS高剂量(200mg·kg-1·d-1)组效果明显,与2型糖尿病模型组相比差异有显著性,在此次实验中降血糖作用优于二甲双胍。同时,ROS用药22d后,有降低2型糖尿病大鼠血浆中TC、TG的水平和增加HDL-C水平的趋势,一定程度上逆转了2型糖尿病脂代谢紊乱。另外,在葡萄糖和肾上腺素致高血糖大鼠模型上,ROS给药组血糖峰值均较未给药的模型组有降低趋势,表明ROS有潜在的降低餐后或生理性高血糖的作用,但这种作用与阳性对照药二甲双胍相比较弱。根据实验数据可以看出ROS对血糖的影响较温和,给药后立即降低血糖的程度较轻,但长期给药的降血糖效果是肯定的。为了探讨ROS为何在2型糖尿病模型上具有降血糖作用的机制,我们以它是否能促进肝糖原的生成、抑制糖异生关键酶G-6-Pase活性和促进胰岛素分泌为切入点进行研究。结果发现ROS灌胃治疗2型糖尿病大鼠22d后有增加大鼠肝糖原含量和血浆胰岛素水平的趋势,并可降低G-6-Pase活性。分析这种作用的机制,我们认为,ROS可能通过促进胰岛素分泌使肝糖原生成增加;通过降低G-6-Pase活性使糖异生减少,最终的效应是使血糖下降。这种降血糖效应不仅在2型糖尿病模型上见到,亦可在肾上腺素或葡萄糖所致的生理性高血糖模型上见到。至于ROS降低TC及TG的机制,我们认为也可能与糖代谢改善有关,但详细机制尚待进一步研究。此外,我们在2型糖尿病大鼠造模的过程中观察到用高脂饲料与STZ联合诱导2型糖尿病大鼠模型的方法具有成模后血糖值较稳定、自身缓解较少的优点。我们在造模的预实验中观察到,通过尾静脉注射STZ(30mg·kg-1)诱导大鼠2型糖尿病的成模率不如文献报道的那么高,与腹腔注射的方式相比成模率相当(60%左右)。另外,长期高脂饲料喂养和小剂量STZ腹腔注射这两个因素在诱导2型糖尿病模型的过程中缺一不可。高脂饲料喂养2mon后血糖值与正常对照并无差别,必须有STZ诱导;在用STZ诱导成功后(血糖值上升到14mmol·L-1以上),如果停用高脂饲料,则空腹血糖值5～7d后会恢复至正常水平(仍表现出“三多一少”的症状),因此这两个诱导因素是相辅相成的。我们通过研究ROS对2型糖尿病动物模型和正常大鼠高血糖模型血糖水平的影响和研究2型糖尿病动物血脂、肝糖原含量、肝脏G-6-Pase活性及血浆胰岛素水平的影响,得出以下结论:地黄寡糖(ROS)在2型糖尿病大鼠模型上具有降血糖、降血脂的作用,也有降低葡萄糖和肾上腺素致高血糖大鼠模型血糖的趋势,一定程度上逆转了糖尿病造成的糖代谢紊乱和脂代谢紊乱,其作用机制可能与促进2型糖尿病大鼠肝糖原的合成、降低肝脏中升高的G-6-Pase活性和促进胰岛素分泌有关,进一步的研究正在进行中。Wistar大鼠,普通级,体重180～220g,♀、♂兼用。由兰州军区兰州总医院动物实验中心提供,自由摄食进水,饲料由该实验中心配制。室温18～25℃。Vitalab21半自动生化分析仪,荷兰VitalScientific公司;BP210S电子天平,赛多利斯有限公司;HP-8453紫外分光光度计,美国惠普公司;IECMicrom