基于rd1区抗原的全血干扰素释放实验对菌阴肺结核的诊断价值

基于rd1区抗原的全血干扰素释放实验对菌阴肺结核的诊断价值

由于缺乏详细的细菌诊断依据，临床表现往往不典型或无异常。细菌阴道的诊断一直是临床医生面临的难题，往往导致诊断和漏诊。皮肤结核菌素试验(TST)是近一个世纪以来一直被用于结核感染和活动性结核诊断的细胞免疫功能的体内试验。由于所使用的抗原结核菌纯蛋白衍生物(PPD)与卡介苗(BCG)及部分环境分枝杆菌(NTM)之间存在交叉反应,使得TST试验容易产生假阳性结果而导致特异性下降,是TST试验的主要缺陷。此外,TST试验在机体免疫功能受损时,常常呈现假阴性或无反应的结果,使得其尽管价廉,但临床诊断意义一直备受质疑。1996年,通过比较基因组学的研究确定了BCG在体外传代过程中丢失的区域,定义为缺失区(RD),ES-AT-6与CFP-10即是RD1区编码的两种早期分泌蛋白,是重要的T细胞抗原,能诱导产生高水平的IFN-γ和强烈的迟发变态反应(DTH),利用结核菌RD1区抗原诱发T细胞免疫应答并使用ELISA的方法检测所产生高水平的IFN-γ的方法是全血γ干扰素释放实验的基本原理。本研究采用全血γ干扰素释放实验的方法,探讨该方法在菌阴肺结核中的诊断价值并探讨其潜在的临床应用潜能,现报告如下。1数据和方法1.1病例对照的年龄分布选取2010年6月至2012年6月北京胸科医院住院患者、新入职职工、健康体检的学生共计182例,男98例,女84例,所有患者要求HIV(-),无妊娠,无应用免疫抑制剂和免疫增强剂史,抗结核治疗少于1周,分为菌阳肺结核组、菌阴肺结核组、肺部其他疾病对照组、健康对照组。菌阳肺结核组44例,年龄17~90岁,平均(46.6±18.4)岁;菌阴肺结核组47例,年龄16~76岁,平均(38.3±16.8)岁;肺部其他疾病对照组56例,年龄36~82岁,平均(55.8±11)岁;健康对照组35例,年龄18~27岁,平均(21.8±2.11)岁。1.2病例对照结果菌阳肺结核组:痰集菌连续至少两次(+)或痰结核菌培养阳性至少1次;菌阴肺结核组:至少3次痰集菌及1次培养阴性,具有典型活动性肺结核临床症状和影像学表现,排除其他非结核肺部疾病,进一步监测经抗结核治疗病变吸收良好病情好转的病例;疾病对照组:包括肺癌(43例)、肺部其他疾病(13例),所有肺癌患者均经活检病理证实,肺部其他疾病主要包括临床或病理诊断的肺炎、肺间质病变、肺部良性肿瘤病例,所有患者无合并活动性肺结核或影像学无陈旧结核病变的病例;健康对照组:为新入职职工和健康体检的学生,要求无结核接触史、无临床症状、胸片检查无异常表现、卡痕阴性、ELISPOT阴性的无其他疾病的健康人群。1.3方法1.3.1血浆样品的收集结核组患者和疾病对照组患者于入院次日清晨抽取空腹静脉血5ml,置于真空肝素抗凝管中;健康组统一采血,清晨抽取空腹静脉学10ml,置于真空肝素抗凝管中。采血后6小时内将静脉血1ml加入24孔培养板内,共5孔,每孔依次加入PHA(阳性对照)、PPD、ESAT-6、ESAT-6/CFP-10和生理盐水(阴性对照),并于5%CO2、37℃细胞培养箱孵育过夜约16~22小时,次日收集血浆至少300μl,于-20℃保存,收集的血浆采用美国BD公司生产的IFN-γ检测试剂盒,严格按照试剂盒要求进行操作。其中PPD、ESAT-6、ESAT-6/CFP-10由中国生物制品检定所王国治主任惠赠。根据预实验的结果,为达到最大刺激浓度,各抗原的终浓度分别为PHA(20μg/ml)、PPD(20μg/ml)、ESAT-6(40μg/ml)、ESAT-6/CFP-10(20μg/ml),最后1孔加入等体积生理盐水。1.3.2roc曲线的构建根据菌阳肺结核组和健康对照组中ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD3种抗原刺激的IFN-γ分泌量,构建ROC曲线,根据曲线下面积确立各抗原cut-off值:ESAT-6的cut-off值为31pg/ml时,敏感性为81.8%,特异性为80%;ESAT-6/CFP-10融合抗原的cut-off值为1458pg/ml时,敏感性为81.8%,特异性为88.6%;PPD的cut-off值为2068pg/ml时,敏感性为86.4%,特异性为60%。1.4评估结果的基准1.4.1esat-6孔PPD孔阳性定义为≥2068pg/ml且3倍于阴性对照孔,阴性对照孔<100pg/ml;ESAT-6孔阳性定义为≥31pg/ml且3倍于阴性对照孔,阴性对照孔<100pg/ml;ESAT-6/CFP-10孔阳性定义为≥1458pg/ml且3倍于阴性对照孔,阴性对照孔<100pg/ml。1.4.2esat-6孔PPD孔阴性定义为<2068pg/ml且阳性对照孔>150pg/ml,阴性对照孔<100pg/ml;ESAT-6孔阴性定义为<31pg/ml且阳性对照孔>150pg/ml,阴性对照孔<100pg/ml;ESAT-6/CFP-10孔阴性定义为<1458pg/ml且阳性对照孔>150pg/ml,阴性对照孔<100pg/ml。1.4.3阴性对照孔阳性对照孔<150pg/ml且抗原孔为阴性时,或阴性对照孔>100pg/ml。由于机体对阳性刺激不反应,或由于污染使得阴性对照孔出现阳性反应,使得无法判定结果为阳性还是阴性,需要重新检测。1.5样本率和相关率实验所得数据应用SPSS16.0进行统计分析,数值型数据行正态性检验,符合正态分布的用均数±标准差表示,非正态分布的采用中位数(M)和极差表示。各组样本率的比较和相关性应用χ2检验。P<0.05差异有显著性。2结果2.1干扰释放实验结果表1比较了ESAT-6、ES-AT-6/CFP-10融合抗原、PPD3种抗原刺激的γ干扰素释放实验在健康组和肺结核组之间阳性率的差异,结果显示健康组和结核组之间存在显著差异,结核组3种抗原刺激的γ干扰素释放实验的阳性率显著高于健康组的阳性率。在去除了无法确定的结果后,这种差异更加显著(P<0.05)。2.2干法释放实验结果表2比较了ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD3种抗原刺激的γ干扰素释放实验在菌阳肺结核组和菌阴肺结核组之间阳性率的差异,结果显示两组差异无显著性(P>0.05)。2.3菌株间的融合表3比较了ESAT-6、ESAT-6/CFP-10融合抗原、PPD3种抗原刺激的γ干扰素释放实验在菌阴肺结核组和疾病对照组之间阳性率的差异,结果显示菌阴肺结核组和疾病对照组之间各抗原存在显著差异,菌阴肺结核组3种抗原刺激的γ干扰素释放实验的阳性率显著高于疾病对照组。ESAT-6/CFP-10融合抗原和PPD的敏感性最好(83.0%),而ESAT-6/CFP-10融合抗原的特异性最好(85.7%),PPD的特异性最差(51.2%),联合ESAT-6或ESAT-6/CFP-10融合抗原任一阳性的敏感性可达83.0%,特异性可达76.8%。在去除了无法确定的结果后,这种差异更加显著(P<0.05)。3全血干扰释放实验的临床应用价值γ干扰素释放实验最早用于结核潜伏感染的研究,近年逐渐用于临床活动性肺结核的诊断和鉴别诊断,实验所使用的设备简单便宜,操作易于掌握,更利于普及。目前国内有关全血γ干扰素释放实验的临床研究还少,需要更加广泛的应用和评价。我国属于结核病高负荷国家,结核菌潜伏感染率较高,为除外结核菌潜伏感染对实验的影响,本研究选择了ELISPOT(-)的35例健康人作为对照组。在疾病对照组的选择上,由于TST实验受BCG接种状态的影响而导致假阳性率很高,使得疾病对照组的选择出现较高的假阳性。本研究仅从流行病学和临床特征选择对照组,即无结核接触史、结核病临床表现,影像学无活动结核和陈旧结核病变的肺癌组和肺部其他疾病组,进一步考察全血γ干扰素释放实验在临床菌阴肺结核的诊断与鉴别诊断价值。在对91例肺结核组(包括菌阳肺结核组和菌阴肺结核组)和35例健康对照组IFN-γ分泌量增高的阳性率比较显示:PPD的敏感性最好(84.6%),其敏感性高的原因主要是PPD为多种抗原的复合物,但是相应的其特异性也最差(60%),主要原因是受BCG接种的影响。ESAT-6与ESAT-6/CFP-10融合抗原的敏感性和特异性接近并无统计学差异;联合ESAT-6或ES-AT-6/CFP-10融合抗原任一阳性可以将敏感性提高至85.7%,而特异性仅轻度下降78.1%,在去除了无法确定结果后联合ESAT-6或ESAT-6/CFP-10融合抗原任一阳性的敏感性可达88.6%,特异性可达79.4%,显示了较好的敏感性和特异性,可用于临床结核病的诊断。3种抗原在菌阳肺结核组和菌阴组中的阳性率无统计学差异。由于菌阳肺结核可以通过痰菌得以确诊,而菌阴肺结核在临床中诊断常常较为困难,因此,全血γ干扰素释放实验对菌阴肺结核的诊断有更大的临床应用价值。本研究中,共有7例无法确定结果产生,均是由于PHA阳性刺激孔无反应产生的,其中,健康对照组仅1例,结核组3例(菌阴肺结核组2例、菌阳肺结核组1例),肺癌组3例,无法确定结果产生可能与机体的免疫功能降低有关。研究表明,无论使用ELISA的方法还是使用ELISPOT的方法,在HIV-TB感染的患者中都出现了一定比例无法确定的结果,并且无法确定的结果更易出现于CD4+T淋巴细胞计数偏低的患者。结核组另外3例无法确定结果,分别产生于菌阴肺结核