口服抗原对自然流产小鼠cd80cd6m表达的影响

口服抗原对自然流产小鼠cd80cd6m表达的影响

生殖人类学认为，当正常妊娠时，胚胎不被母体生理部门排除在外，而是形成一种特殊类型的外部免疫逆流，即抗妊娠免疫逆流。我们以往的研究显示,经口服途径给流产小鼠模型以适当剂量的滋养细胞膜抗原-2(trophoblastmembraneantigen-2,TMA2)和卵清蛋白(ovumalbumin,OVA)后,能有效的诱导妊娠免疫耐受,降低胚胎丢失率,以TMA22mg×5次组和OVA2mg×5次组效果最为显著,为复发性流产的治疗提供了新途径,但其诱导妊娠免疫耐受的机制不明。研究表明,共刺激分子CD80/CD86在T细胞免疫反应、导致克隆无能、产生免疫耐受及疾病的产生等方面可能起重要作用。目前有关口服抗原、共刺激分子与妊娠免疫耐受及复发性流产的研究报道较少。本研究运用流式细胞术双荧光标记法,分析口服抗原前后流产小鼠模型脾、肠系膜淋巴结(mesentericlymphnode,MLN)内巨噬细胞(Mϕ)共刺激分子CD80/CD86表达的变化,探讨CD80/CD86Mϕ在导致流产和诱导妊娠免疫耐受中的作用。近交系小鼠实验动物6～8周龄的清洁级CBA/J(雌性)、DBA/2(雄性)和BALB/c(雄性)近交系小鼠。原种来源于日本国立遗传学研究所,由中国科学院上海实验动物中心遗传室保种,经遗传质量检测符合该品系国际标准。生产许可证号:SCXK(沪)2002-0010;使用许可证号:SYXK(沪)2003-0007。实验方法1.细胞培养细胞的制备以下各组鼠龄及体质量无显著差异。①流产组:CBA/J×DBA/2组合为经典的自然流产小鼠模型,再分为未免疫组、口服TMA2免疫组(2mg×5次,来源于CBA/J(BALB/c滋养细胞,为本实验室制备)和口服OVA免疫组(2mg×5次,Sigma);②对照组:CBA/J(BALB/c组合为常用正常妊娠模型,雌雄小鼠按2∶1交配,自合笼之日起,每天8:00和14:00分别观察1次,如见阴栓即确定为妊娠第1天。2.单个核细胞的制备于非孕期和孕12～14d时,消毒状态下取出小鼠脾脏和MLN,去除脾脏包膜,机械碾碎脾脏和MLN,各加入2mL1640培养液(内含0.5%BSA)混匀,用双层200目尼龙网过滤,取得单个核细胞悬液,然后置4℃下1500×g离心5min(脾脏细胞悬液在离心前还需加入红细胞破坏液15s以破坏红细胞),弃上清液,沉淀加入适量PBS(内含0.5%BSA),200目尼龙网过滤1次,制成单个核细胞悬液,在显微镜下进行细胞计数,调整单个核细胞浓度为1×106备用。3.facsman试验采用双荧光标记流式细胞分析技术。小鼠FITC-CD80、FITC-CD86、PE-CD11b单克隆抗体以及阴性对照抗体均由深圳晶美生物有限公司提供。检测步骤:分别吸取100μL细胞悬液,加入10μLFITC-CD80、FITC-CD86,然后再分别加入10μLPE-CD11b单克隆抗体,置室温下避光孵育15～20min,加入0.5%甲醛20μL固定,上流式细胞仪(FACScan,BD公司)检测。统计学方法实验数据用x±sx±s表示,组间比较采用t检验,P<0.05表明差异有统计学意义。组未免疫组n=6,4.7.MLN内检测结果数据详见表1。1.CD80Mϕ表达:流产未免疫组(n=6)为(10.20±5.42)%,明显高于对照组(n=5)的(1.58±0.70)%(P<0.05);口服TMA2免疫组(n=6)为(2.60±0.58)%,较未免疫组显著下降(P<0.05);口服OVA免疫组(n=6)为(8.12±1.56)%,与未免疫组比较差异无显著性。2.CD86Mϕ表达:流产未免疫组(n=10)为(1.46±0.57)%,明显低于对照组(n=5)的(3.96±0.39)%(P<0.001);口服TMA2免疫组(n=6)为(1.63±0.42)%,与未免疫组比较差异无显著性(P>0.05);口服OVA免疫组(n=6)为(5.12±1.28)%,较未免疫组显著上升(P<0.001)。3.CD80/CD86平均比值:在流产未免疫组为6.99,而在对照组仅为0.39;口服TMA2免疫组与口服OVA免疫组的比值相接近,分别为1.59和1.58,两组均较未免疫组明显下降。脾脏内检测结果数据详见表2。1.CD80Mϕ表达:对照组(n=5)、流产未免疫组(n=7)、口服TMA2免疫组(n=6)和口服OVA免疫组(n=6)分别为(1.64±0.61)%、(5.91±8.71)%、(1.83±0.42)%和(8.13±2.02)%,各组间比较无显著差异。2.CD86Mϕ表达:流产未免疫组(n=5)为(2.34±0.67)%,明显低于对照组(n=5)的(5.98±2.43)%;口服TMA2免疫组(n=6)为(1.35±0.19)%,较未免疫组和对照组显著降低(P<0.05);口服OVA2mg免疫组(n=6)为(6.51±1.59)%,较未免疫组显著上升(P<0.001)。3.CD80/CD86平均比值:对照组为0.27,流产未免疫组为2.52。口服TMA2免疫组与口服OVA免疫组分别为1.35和1.33,两组均较流产未免疫组略有下降。cd80、cd98分子与th1和th2细胞间的相互作用CD80、CD86分子是非常重要的淋巴细胞活化的第二信号,它们均属于免疫球蛋白超家族成员,以单体的形式表达于抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,APC)表面,其受体家族成员也包括2个成员CD28和CTLA4,以单体或同源二聚体的形式表达于T细胞表面;CD28为正性共刺激分子,CTLA4为负性共刺激分子,CD80与CD28亲和力较高,而CD86与CTLA4有较高亲和力。在生理情况下,静止的APC表面几乎无CD80、CD86分子表达,一旦受到抗原刺激,B细胞、DC、Mϕ、以及郎罕氏细胞等APC表面CD80、CD86分子表达会明显增加,继而发挥其共刺激作用。CD80、CD86-CD28/CTLA4之间的相互作用可产生不同的生物学效应,其与Th细胞的分化和细胞因子分泌的关系近来倍受关注。Boussiotis和Kuchroo等通过体内外试验证实,CD80可协助Th1的产生,促进细胞免疫反应;而CD86可能协同Th2的产生,促进体液免疫,下调细胞免疫。此外,利用体内试验也证实Th2细胞克隆的产生更加依赖于CD86/CTLA4相互作用所提供的共刺激信号。目前,有关APC表面CD80、CD86分子表达于自然流产的相关性研究,国内外均未见正式报道。脾脏和MLN是非常重要的外周免疫器官组织,在机体免疫应答中起着重要作用。本研究首次采用双标记流式细胞分析技术检测了自然流产小鼠模型脾脏和MLN内CD80Mϕ和CD86Mϕ的表达,结果发现,未免疫组中,CD86Mϕ表达在MLN和脾脏均显著低于对照组,而CD80Mϕ表达虽然在脾脏内与对照组未显示出差异(可能由于离散度大和样本量不够大之故),但其在MLN中的含量,则较对照组显著增加,根据上述有关CD80、CD86分子与Th细胞分化及相关细胞因子产生的研究结果,结合本文的检测结果,流产的发生与CD80表达的上升,共刺激Th细胞向Th1转化和CD86表达下调,协同刺激Th细胞向Th2细胞能力下降密切相关,再结合以往关于Th1/Th2型细胞因子的检测结果分析,更证实了这一观点。另外还发现,虽然流产小鼠MLN和脾脏内CD80/CD86平均比值较对照组都有所上升,但以MLN内的比值上升更为明显。因此,推测肠相关淋巴组织(gutassociatedlymphtissue,GALT)可能为Th1型细胞因子产生的主要场所之一,原因可能为CD80与CD28结合的亲和力远远超过其与CTLA4,从而产生正性刺激作用。经口服途径给以适当剂量的抗原诱导外周免疫耐受方法,即口服耐受(oraltolerance,OT),由于该方法简便易行且诱导免疫耐受效果好,正日益受到人们的重视。在OT诱导外周免疫耐受的机制研究方面,Rugtiveit等研究发现,肠黏膜Mϕ表面CD80表达增加可以阻断OT的形成,而用抗CD80抗体处理后,可使小鼠恢复OT状态。其原因在于抗体阻断了CD80分子与T细胞表面CD28分子结合,使反应细胞缺乏共刺激信号而不产生免疫应答,这表明共刺激分子可能在OT的形成机制中起着重要作用。本研究观察了口服抗原后产生妊娠免疫耐受较好的两组流产小鼠MLN、脾脏内CD80Mϕ、CD86Mϕ表达的变化,结果显示,口服TMA2免疫组MLN内CD80Mϕ表达明显下降,虽然CD86Mϕ表达量变化不明显,但CD80/CD86平均比值较未免疫组下降显著;在脾脏内情况恰好相反,即CD80Mϕ表达变化不明显,CD86Mϕ表达明显下降。我们推测口服TMA2免疫组产生妊娠免疫耐受机制可能与其诱导CD80表达下调有关,发生的场所可能主要在GALT-MLN,而非脾脏。在口服OVA免疫组,MLN和脾脏内C