结核分枝杆菌抗原刺激后外周血单个核细胞干扰素释放反应

结核分枝杆菌抗原刺激后外周血单个核细胞干扰素释放反应

结核菌素皮肤试验（tst）是诊断核电站杆菌感染的方法之一，已经过去了一个世纪。重要的缺点是无法识别节点性结构性感染和卡介苗（bcg）的免疫接种。近年来,一种新的体外γ干扰素(IFN-γ)释放反应对于结核性感染和结核病的诊断价值引起了研究者的广泛关注。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶联免疫斑点(ELISPOT)法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞(PBMC)对结核分枝杆菌特异或非特异抗原体外IFN-γ释放反应。以结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)为抗原的QuantiFERON-TB试剂盒已在很多国家开始应用,但不能区别结核分枝杆菌潜伏感染者和BCG接种者与非结核分枝杆菌感染者。比较基因组学研究发现,有别于BCG和大多数环境分枝杆菌,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌毒株基因组内存在RD1区。少数分枝杆菌如堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等存在不完整RD1区。结核分枝杆菌RD1区编码一种非常重要的小分子量可溶性早期分泌抗原靶6000蛋白(ESAT6)。ESAT6是一重要的T淋巴细胞抗原,为结核性感染的动物和人免疫活性T淋巴细胞识别并产生高水平的IFN-γ。体外IFN-γ释放及其临床意义的研究由此逐渐展开。38000抗原是一种磷酸盐转运蛋白,属膜结合脂蛋白,一般认为38000抗原存在体液免疫和细胞免疫决定簇,受到研究者普遍关注。Daniel等认为38000抗原仅存在于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中,成为当前结核病血清学抗体检测中采用最为广泛的抗原。何秀云等研究也证实38000可诱发豚鼠迟发超敏反应。我国目前将体外IFN-γ用于结核性感染和结核病诊断的研究尚少见。我们拟通过本研究评价ESAT6、38000抗原在体外PBMC培养系统中IFN-γ释放反应对结核性感染和结核病的辅助诊断意义。对象和方法一、研究主题1.影像学及抗结核药物疗效选取北京市结核病胸部肿瘤研究所结核科结核病患者57例,均依据临床表现、细菌学、影像学或抗结核药物疗效明确诊断,其中男41例、女16例,年龄(43±16)岁,其中肺结核30例(17例痰集菌涂片阳性),肺外结核11例(痰集菌涂片均为阴性),肺内合并肺外结核16例(痰集菌涂片均为阴性)。2.行政、后勤人员选取北京市结核病胸部肿瘤研究所工作人员27例,男9例、女18例,年龄(41±8)岁,均经体检证实为健康者。依照接触排菌结核病患者密切程度分为4级:1级为密切接触者11例,在结核科病房、门诊、放射科、细菌免疫室工作2年以上者,其中有卡痕者6例;2级为中等程度密切接触者6例,在排菌结核病病房工作2年以下或未直接接触结核病患者的行政、后勤人员工作满5年者,其中有卡痕者2例;3级为7例未直接接触结核病患者的行政、后勤人员工作不足5年者,其中有卡痕者2例;4级为3例来自边远地区的新加入本所工作不满1个月者,均无密切接触史,有卡痕者1例。3.研究对象的一般资料选取北京市结核病胸部肿瘤研究所肿瘤科根据细胞学或病理组织学明确诊断的肺癌患者29例,男22例、女7例,年龄(55±13)岁,均尚未进行抗肿瘤治疗。以上所有研究对象均无艾滋病病毒(HIV)感染、妊娠、使用免疫抑制剂或增强剂、严重肝肾功能衰竭史。健康对照组及肺癌组均无陈旧性结核病病灶。二、方法1.血液样本的收集所有患者均于入院后72h内、肿瘤患者于化疗前采肝素抗凝静脉血5ml,健康对照组统一采血。2.病例对照和健康对照组采血后所有受检者前臂皮内注射标准PPDRT23制剂(北京高科生命科学技术公司)0.1ml(20个国际结素单位/ml)。健康对照组由北京市结核病胸部肿瘤研究所流行病研究室工作人员操作,结核组和肿瘤组由有经验的护士操作。72h查验反应结果,记录硬结平均直径。3.pha抑制pbmc产生ifn-者pbmc采用非特异性刺激原植物血凝素(PHA,美国Promega公司)作为阳性对照,PHA不能刺激PBMC产生IFN-γ者除外。PPD抗原、ESAT6抗原由中国药品生物制品检定所王国治教授惠赠,38000抗原由北京第三○九医院庄玉辉教授惠赠。4.规划对模型材料的制备采血后6h内常规分离PBMC,用含10%胎牛血清和10%自体血浆的1640培养液重悬细胞,调整细胞数为每孔1×105,共5孔,根据预实验结果依次加入抗原,其终浓度为PHA10μg/ml、PPD20μg/ml、ESAT633μg/ml和38000抗原20μg/ml,第5孔为无抗原空白对照。各孔终体积为300μl。培养板置于5%CO2、相对湿度为95%的CO2温箱内37℃培养。根据预实验并参考文献确定培养时间为5d,收集培养上清液于-20℃冰箱冻存备用。5.空白对照孔的检测采用法国Diclone公司商用IFN-γ检测试剂盒,严格按照要求操作。该试剂盒IFN-γ检测上限为400pg/ml,下限为5pg/ml。测量前需稀释各抗原刺激培养上清液至适当稀释度:PHA和PPD培养上清液作100倍稀释,ESAT6和38000抗原培养上清液作10～50倍稀释。空白对照孔检测上清原液。鉴于ELISA检测的批间差异较大,本研究采用同一批号试剂盒集中操作。为消除培养基内含有10%自体血浆所致个体误差,抗原刺激PBMC的IFN-γ释放水平表达为:抗原IFN-γ释放=抗原刺激孔IFN-γ检测量-空白对照孔IFN-γ检测量。6.tst与bcg接种史研究所有数据输入计算机,用SPSS10.0统计软件进行分析。健康对照组用Logistic回归对TST与BCG接种史,排菌结核病患者接触程度作逐步回归分析。健康对照组不同抗原刺激后的IFN-γ释放水平与密切接触程度、BCG接种史作单因素方差分析和t检验。不同抗原刺激后IFN-γ释放水平的比较及健康对照组、结核组、肺癌组间IFN-γ释放水平的比较作单因素方差分析。结果一、密切接触程度与ppd皮试的相关性由于目前没有诊断健康人结核性感染的金标准,而根据常识,与排菌结核病患者接触越密切,被感染的机会越大,也就是成为感染者的可能性就越大,故本研究尝试以接触密切程度作为判断健康人结核感染状态的一个指标。采用Logistic逐步回归法分析健康对照组PPD皮试(TST)结果与密切接触程度、BCG接种史的相关性。硬结平均直径≥6mm取值为1,平均直径<6mm取值为0。结果显示:TST反应与BCG接种史和密切接触程度具有相关性(表1)。因此,PPD皮试显然不能鉴别健康者的结核性感染状态。将健康对照组3种抗原刺激后的IFN-γ释放水平与BCG接种史、排菌患者密切接触程度作单因素方差分析和t检验,结果见表2。采用吸光度(A)指数(AI=抗原孔A值/空白孔A值)进一步分析,见表2。以上结果表明:仅ESAT6刺激PBMC后的IFN-γ释放反应可区别不同结核菌接触密切程度,而不受BCG接种史的影响。即可以鉴别健康者的结核性感染状态,而不受BCG接种史的影响。二、肺癌组活性检测由表3可见,3种抗原刺激PBMC释放IFN-γ活性均显示结核组最高,健康对照组次之,肺癌组最低。PPD皮试结果显示健康组最高、结核组次之、肿瘤组最低,但组间比较差异无统计学意义。三、38受试者操作特性曲线由表3可见,PPD、ESAT6和38000抗原刺激后PBMCIFN-γ释放反应中仅38000抗原刺激中发现结核组和健康对照组之间IFN-γ释放水平存在显著差异。为此,我们绘制了所有113例样本的受试者操作特性(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲线(图1)。通过ROC曲线获得最佳域值为1000pg/ml,以此为判断,对结核病诊断的敏感性为64.9%(37/57),特异性为89.3%(50/56),准确性为77.0%(87/113),阳性预测值为86.0%(37/43),阴性预测值为71.0%(50/70)。讨论一、esat6抗体原实验和bcg接种的鉴别鉴于我国在新生儿中实施普遍接种卡介苗政策,干扰了PPD皮试方法进行结核分枝杆菌感染的流行病学调查结果的评价。研究发现ESAT6抗原为结核分枝杆菌特异性抗原,可区分BCG接种和结核分枝杆菌感染两种免疫状态,并可鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌和非结核分枝杆菌感染。本研究结果表明,与皮试结果一样,PPD抗原体外刺激的IFN-γ释放反应同时受接触程度和BCG接种的影响,而ESAT6抗原体外刺激PBMC释放IFN-γ反应可不受BCG接种的影响。因此,其鉴别结核性感染和BCG接种的能力优于PPD抗原的皮试和IFN-γ释放反应,可能发展成有助于评估结核分枝杆菌感染率和结核病控制措施效果的方法。国外研究者也得出相似的结论。另外ESAT6抗原刺激PBMC释放的IFN-γ在结核组与健康对照组间差异无统计学意义,但均显著高于肺癌组。这种差异主要是由于健康对照组多为排菌结核患者接触者,而肺癌组多无明确的接触史。这也进一步证实ESAT6抗原的体外IFN-γ释放反应对结核分枝杆菌感染的诊断价值。由于本研究仅以肺癌作为疾病对照,该结论尚需通过扩大病种范围进一步证实。另外,IFN-γ检测操作复杂,费用昂贵,还需要继续进行临床转化研究。二、肺癌组和肺癌组间比较本研究结果显示,TST结果硬结平均直径在结核组、健康对照组及肺癌组间差异均无统计学意义。由于本研究所选样本均为结核病医院相关人员,因此大多数有被结核分枝杆菌感染的可能。这一结果的得出也就提示TST不能鉴别结核分枝杆菌感染与结核病。三、esat6抗原刺激pbmc释放的ifn-差异虽然国外研究发现与排菌患者密切接触的健康人的PBMC经ESAT6抗原刺激后分泌IFN-γ的细胞数明显高于免疫功能显著抑制的结核病患者。但本研究结果发现,结核病患者和与之密切接触的健康者之间,ESAT6抗原刺激后PBMC释放的IFN-γ差异均无统计学意义。因此,ESAT6抗原的IFN-γ释放反应无法鉴别诊断结核分枝杆菌感染和结核病免疫状态。这种现象可以解释为ESAT6抗原是结核分枝杆菌重要的T淋巴细胞活化抗原,很容易被处于结核性感染和临床结核病发病的不同活化状态的T淋巴细胞所识别,并快速产生高水平的IFN-γ。四、38临床诊断指标在PPD、ESAT6和38000三种抗原之间,仅38000抗原的PBMC释放IFN-γ水平在结核组和非结