参附注射液对兔离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

参附注射液对兔离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

随着心肌保护方法的发展，心脏肌缺血再注损伤机制中的轴向作用越来越受到重视。参附注射液(SFI)的主要有效成分为人参皂甙、水溶性生物碱。有研究表明SFI对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用,但其作用机制尚无定论,用药剂量、给药方式等需进一步探讨。本研究旨在评价含不同浓度SFI的St.Thomas停跳液对心肌缺血再灌注损伤的保护作用,并在线粒体水平上探讨其机制。体外肌肉生化指标动物选择及分组成年日本大耳白兔40只,体重3.8～4.2kg。随机分为5组,每组8只。对照组:用St.Thomas停跳液使心脏停搏;SF1、SF5、SF10、SF15组:分别用含1%、5%、10%、15%SFI(批号020303,雅安三九药业有限公司)的St.Thomas停跳液[(mmol/L):NaCl100.0、KCl16.0、MgCl2·6H2O16.0、CaCl2·2H2O1.2、NaHCO310.0、pH7.4～7.8]使心脏停搏。腹腔注射硫喷妥钠40mg/kg麻醉,耳缘静脉注射4mg/kg肝素后,迅速开胸取心脏,浸入4℃K-H液中,排尽残血后将心脏悬挂于Langendorff灌注装置上,制备全心缺血再灌注模型。以70cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)灌注压经主动脉灌注37℃K-H液[(mmol/L):NaCl118.5、NaHCO325.0、KH2PO41.2、KCl4.8、MgSO4·7H2O1.2、CaCl2·2H2O2.0、葡萄糖11.1,pH7.2～7.6],灌注中持续通入混合气(O2:CO2=95%:5%),并将心脏移入37℃保温缸内。平衡灌注30min时各组分别以不同停跳液20ml使心脏停搏,停灌45min(37℃保温、保湿)再灌注40min。线粒体的分离再灌注40min,快速取下心脏,取左、右心室肌剪碎,用预冷的4℃匀浆介质(250mmol/L蔗糖、10mmol/LTris-Hcl,pH7.4)制成10%组织匀浆。4℃下1000×g离心10min弃去沉淀,重复一次后取上清液10000×g再离心10min,沉淀即为纯化的线粒体。指标测定收集再灌注10min时冠脉流出液5ml,7170A全自动生化分析仪(Hitachi公司,日本)免疫抑制法测定磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性;考马斯亮兰法(试剂盒由南京建成生物有限公司提供)测定线粒体蛋白含量;取线粒体悬浮液1ml,蒸干后马弗炉灰化,分析纯浓硝酸、高氯酸加热消化,以同时测得的线粒体蛋白含量定标,定容后Z-5000型原子吸收光谱仪(Hitachi公司,日本)测定线粒体Ca2+含量,硫代巴比妥酸法(试剂盒由南京建成生物有限公司提供)测定线粒体丙二醛(MDA)含量。线粒体形态学观察取右室流出道0.2cm×0.2cm×0.5cm全层心室肌标本,常规固定、染色、超薄切片后H-600透射电镜(Hitachi公司,日本)观察心肌超微结构并行线粒体评分,参照Flameng法,每个标本取5个不同视野,每个视野随机选择20个线粒体行Flameng评分。参照文献,选用比表面(δ)和面数密度(NA)为指标,CM-2000B生物医学图像分析系统根据体视学原理进行线粒体定量分析。计算公式为:NA=Nx/Ar,δ=Sx/Vx。Ar为参照系的截面积,Nx为参照系中线粒体截面数目,Sx为线粒体表面积,Vx为其体积。统计学处理用SPSS11.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差()表示,组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。两组小鼠心肌组织病理学检测与对照组比较,SF1、SF5、SF10组冠脉流出液中CK-MB活性降低,线粒体MDA、Ca2+含量及Flameng评分降低,线粒体NA增高,SF5、SF10组线粒体δ增高,SF15组冠脉流出液CK-MB活性增高,线粒体MDA含量降低,Ca2+含量升高(P<0.05或0.01)。见表1。电镜下对照组及SF1组肌原纤维断裂、溶解,Z线增宽、模糊,出现异常收缩带,线粒体肿胀变形、基质密度降低、嵴排列紊乱,见图1,2。SF5和SF10组线粒体肿胀不明显、排列较整齐,基质密度均匀,嵴排列紧密,内外膜清晰可见,见图3,4。而SF15组线粒体肿胀变形明显,基质呈空泡状,部分嵴解体、消失,甚至线粒体膜破裂、内容物流失,见图5。变质剂对心肌缺血再灌注损伤的作用本研究采用经典的Langendorff灌注装置制备离体心脏缺血再灌注模型,根据预实验将SFI加入停跳液中,当SFI浓度>15%时,再灌注后心脏复跳率明显降低,因此本研究选择1%～15%浓度范围筛选适宜浓度。本研究中对照组心肌病理学损伤严重,表明心脏停跳后复跳可产生心肌缺血再灌注损伤;冠脉流出液中CK-MB活性可反映心肌损伤程度,SF5、SF10组心肌病理学损伤较对照组轻,冠脉流出液中CK-MB活性也低于对照组,表明St.Thomas停跳液中含5%～10%SFI对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用。而SF1组心肌病理还损伤与对照组相似,SF15心肌病理还损伤较对照组严重,表明St.Thomas停跳液中含15%SFI可加重心肌缺血再灌注损伤。线粒体是对再灌注损伤异常敏感的细胞器,其结构或功能异常可造成进一步的能量代谢障碍、氧自由基生成增加、钙稳态紊乱,导致恶性循环。Flameng评分是对线粒体形态学的综合评价,由于半定量指标带有一定主观性,因此将其结合线粒体体视学这一定量指标了解线粒体损伤程度更为客观、可靠。NA增高反映线粒体肿胀变形较轻,δ增高提示心肌组织水肿较轻,线粒体崩解较少。与对照组比较,本研究中SF5、SF10组NA、δ增高,并且Flameng评分降低,表明St.Thomas停跳液中含5%～10%SFI对心肌缺血再灌注后线粒体损伤有较好的保护作用。缺血再灌注时,线粒体的损伤主要来自氧自由基的攻击和线粒体钙超载。MDA是过氧化脂质的分解产物,可间接反映氧自由基产生的多少。线粒体MDA含量可作为评定线粒体受氧自由基攻击严重程度的指标。Ca2+超载是心肌缺血再灌注发展为不可逆阶段的共同途径,导致细胞不可逆损伤的根本原因是线粒体Ca2+超载。本研究结果表明,St.Thomas停跳液中加入5%～10%SFI,能减少心肌缺血再灌注后冠脉流出液中CK-MB活性,降低线粒体MDA含量,减轻线粒体Ca2+超载,但当SFI浓度达到15%时心肌CK-MB活性增加,线粒体内Ca2+负荷增加,而此时线粒体MDA含量并未超过对照组,但高浓度可加重心肌损伤,线粒体Ca2+超载可能是其