高致病性猪蓝耳病变异病毒nsp2基因的分离鉴定

高致病性猪蓝耳病变异病毒nsp2基因的分离鉴定

自1987年keffender在美国报道了猪繁殖和呼吸综合征（iu）以来，该疾病已成为世界养猪业最严重的疾病之一。这种疾病的猪看起来像是精神障碍、发烧、厌食和呼吸困难。祖母流产、产仔生育、虚假怀孕和产仔生育。公猪的功能已经降低，造成了严重的经济损失。1996年郭宝清等首次从北京地区暴发流行猪病的流产胎儿体内分离到PRRSV,命名为Ch-1a,从而证实了该病在我国的存在。2001年至今,我国每年都有部分地区和猪场不同程度地受到猪“高热病”的危害,其中以2006年夏秋之季,我国部分地区安徽、江西、浙江、湖南、湖北、江苏等省猪“高热病”疫情尤为严重,有“三高一低”之称。2007年5月份入夏以来,东南及中南一些省份的猪场再次遭受该病的侵袭,大部分发病猪场的发病率为10%~90%,死亡率为20%~80%。7月份,宁夏大面积暴发,9月份,又从甘肃分离到1株,可见该病已在全国各地蔓延。由于开始时不清楚该病的主要病原,称其为“猪无名高热”。后来一系列的研究表明,引起该病的最主要病原为变异的PRRSV。PRRSV属套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arterividae)动脉炎病毒属,同属的有马动脉炎病毒(EAV)﹑小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV),为单股正链有囊膜的RNA病毒,病毒粒子呈球形或卵圆形,直径为45~65nm,含有20~35nm的核衣壳,呈二十面体对称,外绕一脂质双层膜,表面有纤突,较小且不清楚。在蔗糖中的浮密度为1114g·mL-1,在氯化铯梯度中浮密度为1119g·cm-3。具有“帽子”结构和poly(A)尾。血清学试验及结构基因序列分析表明,PRRSV可分为2种基因型,即欧洲型(代表株为LV)和美洲型(代表株为VR2332)。前者主要流行于欧洲地区,后者主要流行于美洲和亚太地区。PRRSV基因组约15kb,含有9个开放阅读框(ORF)。ORF1a和ORF1b主要编码病毒的复制酶,约占据病毒基因组的80%。ORF2a-5编码病毒的囊膜糖蛋白,ORF2b编码一个非糖基化的结构蛋白,ORF6编码基质蛋白,ORF7编码病毒的核衣壳蛋白。经过对分离的PRRSV测序表明:与经典毒株相比,病原的基因序列变化主要是在Nsp2区缺失了30AA,并且经典毒对猪没有流行毒如此高的致死率。可见,Nsp2缺失与否成为区分高致病性猪蓝耳病与经典蓝耳病的重要指标,故分析Nsp2基因成为分析新毒株的首选。1材料和方法1.1疾病和主细胞病料为采自甘肃兰州猪场发病死亡猪的血样。猴肾细胞(Marc145),由中国兽医药品监察所引进,本实验室常规传代培养并保存。1.2pcr和转酶系统新生牛血清购自兰州荣晔生物科技有限责任公司;DMEM、胰蛋白酶购自Hyclone公司;Taq聚合酶、dNTPMixture、RnaseInhibitor、AMV、10×PCRbuffer等均购自宝生物(大连)有限公司。猪蓝耳病病毒检测试剂盒购自北京元亨世纪公司。1.3缺失片段下游引物设计参照经典毒株PRRSV-ch-1a和高致病性变异毒株06年流行基因序列,设计包含缺失区段的上下游引物,P1:5′-GAGCCGAATAACACCTATGA-GT-3′;P2:5′-AGAGTCGGTGTAGGCTTGAGC-TGAGTATTT-3′,预期扩增片段为370bp。1.4中毒植物的分离和鉴定1.4.1细胞病变活性观察选择细胞形态正常,形成良好单层的Marc145细胞4~6瓶,其中2瓶作空白对照,倾去旧的培养液,用维持液洗细胞表面2次,然后接种处理好的病毒材料,1~2mL·瓶-1,静置于37℃温箱内吸附1h(期间轻摇2~3次,使病毒与整个细胞面充分接触),添加病毒维持液4~9mL,以覆盖细胞层为度。继续置37℃恒温箱内培养,每隔12或24h镜检一次,观察致细胞病变产生情况。到第5天时,细胞出现典型细胞病变,收毒,将其置于-70℃,反复冻融,离心,上清(记作F1)接种正常细胞,同上连续传代,待其收毒时间稳定,保存备用。1.4.2pcr扩增dna采用猪蓝耳病病毒检测试剂盒鉴定。利用异硫氰酸胍法提取RNA(为避免基因发生变异,以低代次F2代细胞毒为材料),在反转录酶的作用下,以RNA为模板,以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异片段的基因拷贝数放大一倍。经过35次循环,最终使基因放大了数百万倍。将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到扩增特异片段的DNA带。操作按照试剂盒说明书进行,并设阴、阳性对照。如果阴、阳性对照成立,并且扩增出660bp左右条带,则检测结果成立。将分离的PRRSV命名为Gs/Lzh/07株。1.5基因特征分析21.5.1pcr扩增条件将已鉴定为阳性的PRRSVGs/Lzh/07株F2代细胞毒用RNeasyMiniKit试剂盒提取病毒总RNA,操作方法按说明书进行。取5μLRNA,加入5×buffer5μL(Mg2+)、dNTPMixture(2.5mmol·L-1)4μL、RNaseinhibitor(40U·μL-1)1μL、下游引物P21μL、AMV酶(5U·μL-1)1μL、DEPC水3μL,混匀后置42℃水浴1.5h。反转录产物-20℃保存备用。以P1、P2为引物进行PCR,PCR反应条件:94℃预变性4min;94℃变性1min,57℃退火40S,72℃延伸1min,共30个循环;72℃延伸10min。扩增结束后取5μLPCR产物进行电泳检测。1.5.2基因序列分析：ssp2将鉴定为阳性的PCR产物送大连宝生物公司测序,将测序结果与经典毒和流行毒序列利用生物学软件DNAStar进行比较。2结果2.1细胞毒性试验从Marc145细胞上成功分离到1株Gs/Lzh/07毒株。培养的正常细胞形态较好,轮廓清楚,界线清晰,如图1A所示;该毒株在Marc145细胞上产生明显的细胞病变:接毒1d后单层细胞变圆,细胞界限基本可见;2d后细胞完全失去正常形态,界线模糊不清;3d后细胞溶胀并形成小圆形的细胞丛;4d后大量感染细胞核圆缩,细胞空泡化并脱落;5d后CPE波及整个细胞单层,出现密集裂隙,如图1B-F所示。2.2鉴定结果阳性对照按照猪蓝耳病病毒检测试剂盒说明书,扩增出了660bp左右的条带,阴、阳性对照成立说明鉴定结果为阳性,如图2所示。进一步验证了从Marc145细胞上分离的Gs/Lzh/07毒株是PRRSV,并且该毒株能使Marc145细胞产生CPE。2.3pcr扩增检测以鉴定为阳性的F2代细胞毒为材料,提取试剂盒提取的RNA为模板,P2为反向引物反转录后,用P1,P2引物进行扩增,经电泳检测,结果获得370bp左右条带,与预期片段大小相符(图3),说明已成功扩增出目的基因。2.4脂肪酸和氨基酸序列直接将扩增得到的PCR产物测序,所测序列与经典毒PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与2006-2007年流行的高致病性变异毒株核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,而且缺失30个氨基酸,可以断定就是2006-2007年流行的高致病性变异猪蓝耳病毒株。序列比对结果见图4。3prrsv在猪体内的凋亡本研究成功分离到一株Gs/Lzh/07病毒,并采用RT-PCR方法进行了鉴定,确认了该次疫病中存在PRRSV。在分离过程中发现:Marc145细胞培养较为困难,培养周期长,分种率低;分离病毒也相对较难,繁殖周期长,对pH值要求高,通常,一代毒需要5d左右。病毒接种细胞后,要严格控制在pH6.5-7.5,否则,病毒滴度下降特别快,其他猪病病毒则控制在pH7.6-7.8时活性较高。有研究表明PRRSV感染Marc145细胞后,能在该细胞表面表达一种波形纤维蛋白,它很可能是PRRSV受体复合物中的一个重要组成成分,在PRRSV结合宿主细胞的过程中发挥重要的作用。有学者将猴的波形蛋白导入BHK-21或CRPK,可使PRRSV对这些细胞变得易感。近来研究发现由PRRSVORF5编码的糖蛋白GP5在COS-1细胞表达时能诱导体外培养的细胞发生细胞凋亡。Suarez和Sirinarumitr等检测到了感染猪肺部细胞的凋亡,包括肺泡巨噬细胞、血管内巨噬细胞和单核细胞;在淋巴结中也检测到发生凋亡的实质巨噬细胞和单核细胞。张晓梅等发现Am-PRRSV(美州型-PRRSV)感染早期可以诱导受感染猪外周血单核细胞和肺泡巨噬细胞的细胞凋亡,此凋亡可能是导致PRRSV相关病变及免疫抑制的重要机制。通过对病毒的非结构蛋白Nsp2基因序列分析,并与GenBank上下载的2006-2007年流行毒株序列比较发现,Nsp2基因缺失30个氨基酸,是目前流行的高致病性变异株,有着该病毒本身的特殊性。该分离毒株Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a和2006-2007年流行的高致病性变异毒株核苷酸同源性为83%~95.5%,氨基酸同源性为72%~90.9%。ORF1a中推测的非保守氨基酸的改变主要集中在Nsp1β和Nsp2,其中尤以Nsp2的变异性较大,但都不在特定的催化或切割位点处。例如,欧洲型PRRSVNsp2在734-750位氨基酸之间存在一段长达17个氨基酸的缺失区。即使在同一基因型之间,Nsp2也表现出很大的差异。如高志强等报道同为北美洲型的HB-2株、BJ-4株、VR2332株和CH-1a株,其Nsp2的氨基酸序列同源性在78.3%~88.9%,而且HB-2株在该区存在12个氨基酸缺失现象。近两年流行毒又出现缺失30个氨基酸的Nsp2区。研究表明,Nsp2蛋白具有耐受碱基插入或突变的能力。据报道,该蛋白可能与PRRSV对组织和细胞的亲嗜性有关,可能决定动脉炎病毒的种属特异性,因此他可用于监测PRRSV的变异以及发展成为一个特异性诊断技术的理想标志。在已知的RNA病毒中,PRRSV是变异率较高的病毒之一。PRRSV因为不断变异才在大约100年前由其他物种转移到猪体内,这种宿主的更换不仅涉及到免疫位点的改变,也牵涉到病毒跨膜区的变异(包