植物生物技术：第五章-单倍体细胞培养课件

第五章 单倍体细胞培养第五章1第一节 单倍体及其应用价值第二节 离体花粉/小孢子发育途径第三节 花药培养与花粉培养第四节 植物单倍体育种本章主要内容第四章2本章教学目的与要求概念：花粉培养，花药培养，花粉二型性单倍体的应用价值离体花粉的发育途径花粉培养与花药培养的比较第四章34第一节 单倍体及其应用价值一、概念二、单倍体的起源三、单倍体植物的特点及遗传行为四、单倍体的应用价值第五章一、概念单倍体是指具有配子染色体数的个体或组织，体细胞染色体数为n单倍体细胞培养主要包括三个方面：花药培养花粉培养未受精子房及卵细胞培养第一节5二、单倍体的起源①

种间和属间杂交

远缘杂交中，异种植物虽然不能与母本授粉、受精，由于远缘花粉的诱导作用，卵细胞在没有受精的情况下受刺激而发育成胚土豆、大麦、小麦、玉米②

物理照射和化学诱变

花粉用射线照射后失去了受精能力，然后与母株授粉，卵细胞在花粉的刺激作用下进行孤雌发育，从而产生单倍体烟草、小麦、金鱼草第一节6③ 双生苗的筛选（selection

of

twins）有些植物可产生多胚种子，即两个或多个胚被共同的种皮包裹着，这些种子可产生单倍体-单倍体、二倍体-二倍体和单倍体-二倍体植株在辣椒中，双生苗的频率受母本基因型控制通过筛选可以提高双生苗的频率④花药和花粉培养第一节7三、单倍体植物的特点及遗传行为1、单倍体分成两类:一倍单倍体（monohaploids），这类单倍体起源于二倍体物种多倍单倍体（polyhaploids），这类单倍体起源于多倍体（如4X，6X等）第一节8diploid 植物其haploid即为monoploid玉米2n=2x=20n=x=10水稻2n=2x=24n=x=12柑橘2n=2x=18n=x=9tetraploid植物其haploid为dihaploid马铃薯

2n

=

4x

=

48

n

=

2x

=

24陆地棉

2n

=

4x

=

52

n

=

2x

=

26hexaploid植物其haploid为triploid普通小麦2n

=

6x

=

42

n

=

3x

=

21octoploid植物其haploid为tetraploid草莓

2n

=

8x

=

56

n

=

4x

=

28第一节92、单倍体植物的特点体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小；雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代3、单倍体的遗传行为一倍的单倍体只有一个染色体基数（X），减数分裂时染色体不能配对，分离极不正常但具有一定同源关系的染色体可以部分配对，从而可以对染色体的演化过程进行研究第一节1011四、单倍体的应用价值母本×父本F1F2花药培养花粉植株加倍选择鉴定品系比较试验区域试验品种5—8代（一）、缩短育种周期第一节（二）、提高目标基因型的选择效率12如果某一性状受一对基因控制–AA×aa→F1→F2中纯合AA个体只有1/4–F1采用花药或花粉培养，产生的后代中AA个体占1/2，比常规杂交育种提高一倍如属两对基因控制–AAbb×aaBB,

F2中要选出AABB个体的机率只有1/16–F1采用花药或花粉培养，AaBb只产生4种花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后

AABB个体的频率可达1/4–比常规杂交育种效率提高4倍常规育种：单倍体育种=1/22n：1/2n。（三）、排除杂种优势对后代选择的干扰对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不同程度的杂种优势表现，对个体的选择会造成一定误差采用DH群体进行选择育种，由于各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能更大程度上代表真实变异第一节13（四）、遗传研究的良好实验材料体系单倍体在作物的数量遗传研究中可能有较大用途，如：基因相互作用的检测、遗传变异的估计、连锁群的检测、影响数量性状的基因数目的估计及多基因的定位等DH系是分子标记遗传作图的良好群体单倍体可用来创造非整倍体材料，用单倍体与二倍体杂交，可创造一系列的附加系，从而研究染色体的遗传功能花药和花粉培养体系还是发育遗传研究的良好材料，可以用来研究细胞的分裂及分化，研究花粉发育途径的转变，以及与转变有关的基因的表达与调控第一节14（五）、突变体的筛选单倍体的每个基因都是单拷贝的，各种隐性基因都可以表现出来，加

倍后形成的双单倍体各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，大大提高了抗性或其它突变体的筛选效率对花药进行离子照射，然后对花药愈伤筛选，可以获得理想的突变体第一节15（六）、消除致死基因单倍体带有致死基因的个体即使加倍后形成双单倍体也会由于基因的纯合而被消除而致死基因在自然群体里常常因为杂合体的存在而不易被彻底消除。（七）、选育新型自交系对双亲或多亲杂交的杂种一代进行花药或花粉培养，获得的双单倍体实际上是纯合的自交系，在杂种优势利用育种中有很大用途第一节16（八）、遗传转化的受体材料在转基因育种中，如果用体细胞为受体，经常遇到转基因后代材料分离问题，经多代选择才能稳定下来如用单倍体细胞作受体，获得的转基因材料经加倍后，从理论上讲会很快达到纯合状态受体材料可以是花粉、单倍体原生质体、单倍体胚或单倍体植株作外植体第一节本节完17第二节 离体花粉/小孢子发育途径一、花粉/小孢子的正常发育阶段二、离体小孢子的发育途径三、雄核发育启动机理第二节18一、花粉/小孢子的正常发育阶段19（一）、花粉不均等分裂途径(A途径

)小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞。营养细胞发育途径:由营养细胞重复分裂形成单倍体生殖细胞发育途径:由生殖细胞重复分裂形成单倍体营养细胞和生殖细胞并进发育途径:由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株二、离体小孢子的发育途径第二节2021第二节（二）花粉均等分裂途径（B途径）小孢子第一次有丝分

裂为均等分裂，形成

大小相近的两个细胞。然后由这两细胞继续

分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍

体植株221、雄核发育与P花粉的形成花粉的二型性：在花药/花粉培养时，由于对培养条件的反应不同，花粉在形态上形成两种类型，一类是具胚性的，在烟草和大麦中，花粉小，染色浅；另一类为花粉大，染色深，朝成熟花粉方向发展P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）三、雄核发育启动机理第二节23在烟草和大麦中，花粉小，染色浅，为胚性的胚性小孢子第三节24水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（约10%）比非胚性小孢子大、高度液泡化胚性小孢子第三节252、逆境处理与雄核发育的诱导热激处理物理或化学处理低温处理营养饥饿处理重金属胁迫激发花粉产生原胚促使细胞同步分裂改变细胞分裂周期第二节本节完第三节 花药培养与花粉培养一、花药培养操作技术二、花粉培养操作技术三、单倍体植株再生、鉴定及加倍四、花粉培养与花药培养的比较五、影响花药培养的因素六、禾本科植物花药培养中的白化苗现象第三节26花药培养:是植物雄性生殖器官-花药为外植体离体培养技术，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。也称为小孢子培养(microspore

culture)27一、花药培养操作技术1、取材镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。2、消毒

70％酒精浸泡30-60s花蕾后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min，无菌水冲洗3-5次。3、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。第三节28二、花粉培养操作技术(一)花粉的分离与纯化1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。3、机械游离磁搅拌法：用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；超速旋切法：通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子第三节29(二)花粉培养方式1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养：花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养：花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养：利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。第三节30看护培养：第三节31（一）花粉植株的形态发生方式1、器官发生型花粉-----多细胞花粉粒----细胞团（愈伤组织）-----继代培养-----单倍体植株。2、胚状体发生型花粉-----多细胞花粉粒----进一步培养----胚状体-----释放-----植物体。第三节32三、单倍体植株再生、鉴定及加倍第三节33（二）、单倍体植株鉴定1、染色体直接计数法：通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定流式细胞仪鉴定：主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。细胞形态学鉴定法：叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。第三节34（3）植株形态学鉴定法：单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。杂交鉴定法：自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。分子标记鉴定 如RFLP、RAPD、AFLP等第三节35（三）、染色体加倍

茎段培养：将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。化学试剂诱变：秋水仙素诱导浸泡法：无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。生长锥处理：秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。培养基处理：将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。第三节36花药和花粉培养基本流程：选择合适的供体植株（F1）预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。倍性鉴定或染色体加倍第三节37四、花粉培养与花药培养的比较第三节38花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小孢子启动第一次分裂，小孢子培养则不会花粉已是单倍体细胞，诱发都是单倍体植株或双单倍体，不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株花粉培养获得的材料总是纯合的由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，是遗传与发育研究良好的材料体系供体植株的生长条件烟草：短光周期（8h）和高光强（16000lux）大麦：低温（12

℃ ）和高光强（20000lux）油菜：高光强和一定的温度变化2.

供体植株的年龄多数情况下幼年植株优于老年植株第三节39五、影响花药培养的因素3.

花粉发育时期花粉发育时期对诱导雄核发育非常重要一般从单核早期到双核早期第三节发育时期

减数分裂期四分孢子期单核早中期单核晚期单核早期至晚期40物种草莓、番茄葡萄大麦、天仙子、马铃薯

荔枝、茄子、青椒、小麦烟草梨、水稻、甘蓝单核早期至双核期41花粉发育时期的确定花药在接种以前，一般需先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系根据花蕾和花药的长度判断小孢子发育时期，从而为取材提供参考第三节单核晚期第一次有丝分裂后期双核早期双核中期4. 花蕾和花药的预处理：低温、EMS、秋水仙素、γ射线、酒精、高低渗、饥饿处理、高温处理、重金属胁迫等低温预处理：烟草

3～5℃

72小时水稻

10℃

10～14天第三节425.

供体植株的基因型供体植株的基因型是影响花药培养和花粉培养的关键因素不同基因型的植株对培养的反应不同表现为是否可诱导胚状体的生成，生成胚状体的多少，以及由胚再生成植株的能力大小第三节43基因型接种愈伤再生率（%）植株数/花药花药数产量绿苗率 白苗率绿苗数白苗数 绿苗/白苗Igri18010.5733.3316.673.521.672.0IgriHO42012.9230.643.233.960.429.4IgriH118022.1830.3018.186.724.031.7Atias

608.577.147.140.610.611.0No.1

G.N.12014.144.004.000.570.571.0Doublet18011.6615.007.501.750.872.0Harrington3002.1223.535.880.500.124.2Triumph2402.6266.6716.671.750.444.0Goft1801.1416.6711.110.190.131.5Wen

I2401.6310.0013.330.160.220.7Ht/Gm

F63002.8220.005.000.560.144.0No.3

Z.S/Igri

F124010.2014.2928.571.462.910.5G.M.R.T./Igri

F16012.5311.547.691.450.961.5Harrington/IgriF1

608.4033.3333.332.802.801.0Igri/Harry

F118038.6137.5016.6714.486.442.2Igri/J.Q.F112027.8756.2518.7515.685.233.0平均—11.55

24.6212.82

3.341.64—大麦基因型对花药培养效果的影响反应差反应好第三节446.

培养基：①花药培养常用的基本培养基种类MSNitschN6B5第三节45②渗透压花药培养时往往需要一定的渗透压，成熟花粉是二细胞结构的，往往需低浓度糖成熟花粉为三细胞结构的植物往往需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖的浓度可用到13-17%番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应:蔗糖浓度

2％

3％

4％

6％

10％

13％

17％诱导频率

5％

10％

12％

18％

25％

45％

8％第三节46③激素2，4-D对启动分裂和愈伤的增殖往往有刺激作用，但对分化却有抑制作用，在诱导单倍体愈伤分化时，应及时降低或去除2，4-D高浓度的2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织，增加了二倍体细胞发育的机会在茄子中的研究表明：MS＋2,4-D

0.5mgl-1＋KT

1mgl-1，n

-93.8%

，2n

-6.2%MS＋2,4-D

2mgl-1

＋

KT

1mgl-1，n

-64.1%

，2n

-35.9%第三节47④氮素的量和各种氮素的比例朱至清等（1974）在水稻花药培养中改变培养基中无机氮源可以显著改变花粉形成愈伤组织的频率，随后又能影响由愈伤组织分化绿苗的频率在他们所研制的N6培养基中，供试的三个水稻品种花粉出愈率分别为

37.7%,32.2%和7.5%，而在Miller培养基上分别只有15.5%,10.8%和0%N6与Miller培养基中氮的组成有明显不同为禾本科作物的花药培养主要使用N6培养基第三节48⑤有机物质在大麦和小麦的花药培养中，谷氨酰胺对小孢子胚形成具有明显的促进作用对于某些植物种来讲，添加某种植物的提取物或椰汁可以改善培养效果第三节49⑥有些作物的花药对培养基的pH值有一定要求在曼陀罗的花药培养中，观察到随着pH值的变化，产生胚