山西灰霉病菌的抗性及防治对策

山西灰霉病菌的抗性及防治对策

灰霉菌是一种严重的世界疾病，尤其是各种园艺作物的破坏。这种疾病主要影响水果和花朵，因此在生产上会造成严重的经济损失。其病原灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.是一种重要的弱寄生植物病原菌,其寄主范围很广,至少可以侵染235种植物,引起多种作物的灰霉病。现已成为山西露地和保护地蔬菜的主要病害,近几年发生和为害呈现逐年加重的趋势。长期以来生产上主要靠化学防治控制其为害,但灰霉病菌具有繁殖速率高、遗传变异大和适合度高的特性,多年连续大量使用化学药剂使得这种病原菌对一些杀菌剂已产生了抗性,田间普遍反映常用杀菌剂的防治效果下降,菜农不得不加大杀菌剂用量和增加使用次数来进行防治,保护地蔬菜从定植开始几乎每周喷洒一次杀菌剂,也难以收到良好的防治效果。这样不仅大幅度增加了蔬菜生产成本,而且造成了蔬菜和环境的严重污染,直接影响了消费者的身心健康。因此,山西灰霉病菌是否产生抗药性,抗性频率和抗性水平如何,应采取什么治理对策,已是蔬菜生产上亟待解决的问题。作者于1998～2002年对采自山西省不同地区的灰霉病菌对常用杀菌剂多菌灵的抗性进行了监测,明确了各地的抗性程度及抗性频率,对生产上合理用药具有一定的指导意义。1材料和方法1.1省划分及划分根据各地区在蔬菜生产中对灰霉病进行化学防治的总体用药历史和用药水平,将山西省划分为四大地区进行调查:晋中地区(包括晋中、太原、吕梁三个行政地区)、晋南地区(临汾和运城两个行政地区)、晋东南地区(长治和晋城两个行政地区)和晋北地区(忻州、朔州和大同三个行政地区)。在各调查区内保护地蔬菜进行广泛的采样。1.2根据测定内容进行取样被调查的灰霉菌样取自保护地主要作物番茄、黄瓜和西葫芦的罹病果实或花托,按照随机取样的原则进行。取样后将各病组织分别装入小袋或小瓶中使其彼此隔离,以防不同菌株间相互污染。病组织带回后对病菌进行分离、纯化、及单孢分离,并立即进行抗性测定。菌株以“采样地点(市或县)的小写拼音字头(声母)+序号”命名。1.3试验试剂97.3%多菌灵原粉,由山东双星农药厂提供。1.4tween80的添加97.3%多菌灵原粉用0.1N稀HCl配成5000μg·mL-1母液,以0.2%的量加入乳化剂Tween80。母液在4℃冰箱中贮藏,用时以无菌水稀释至适当的浓度,以不大于10%的药液量加入熔化的PDA培养基中充分摇匀,制成含最终所需浓度药量的PDA平板,用以进行抗药性鉴定和抗药性水平测定。1.5生长抗菌材料的筛选用MIC法(最低抑制浓度法),鉴别浓度采用Yarden的标准,多菌灵以0.5μg·mL-1、50μg·mL-1鉴别敏感、中抗和高抗,即不能在含药0.5μg·ml-1的平板上正常生长的为敏感菌株,能在0.5μg·mL-1上正常生长但EC50值小于50μg·mL-1为中抗菌株,EC50值大于50μg·mL-1为高抗菌株。经分离纯化的新鲜病菌,取直径5mm的菌块接种于含鉴别浓度的PDA平板上,在(20±1)℃培养48h后,观察生长情况。统计各调查地区的敏感和抗性菌株的发生频率。1.6抗菌性菌株对多菌灵表现敏感(S)、中抗(RM)或高抗(R)类型。1.7生长抑制率测定采用FAO推荐的菌落直径法。对多菌灵的敏感与抗性菌株各随机选取若干代表菌株,在含药平板上进行毒力测定。毒力测定设置5～7个梯度浓度,以不加药剂为对照;每浓度重复3皿。各浓度设置如下(单位为μg·mL-1):多菌灵的敏感菌株为0.02、0.03、0.04、0.06、0.08,中抗菌株为2.5、5、10、15、20、25、40,高抗菌株为50、100、200、400、800、1000、1500,在灰霉菌的菌落生长边缘打取直径为5mm的菌块,接种于各药剂浓度的平板上,在20℃黑暗培养48h,测量菌落直径。根据菌落在不同浓度药剂的平板上生长抑制率,用SAS软件计算抑制中浓度EC50值和EC90值。各取平均后,计算抗性菌株EC50值与敏感菌株EC50值之比,即得相应的抗药性倍数。2结果与分析2.1灰霉病菌的抗性特征在山西省4个调查地区的22个市县,共采集并成功分离到188个灰霉菌株,其中晋南地区86个,晋中地区50个,晋东南地区31个,晋北地区21个。在室内对各菌株进行了抗药性鉴定,共得到多菌灵的敏感菌株20个,中抗菌株74个,高抗菌株94个;各地区灰霉病菌的抗药性频率有一定的差异。由表1可见,晋中地区的灰霉菌对多菌灵的抗性频率为86.0%;以中抗菌株为主,占群体的58.0%;晋南和晋东南地区总体抗药性水平都较高,抗性菌株分别占到87.2%和93.5%;而敏感菌株分别只有12.8%和6.5%,多菌灵的抗性菌株占绝对优势;晋北地区,所测菌株全部为多菌灵的抗性菌,其中以中抗菌株为主,占66.7%。从以上4个地区的测试结果可以看出灰霉菌株抗多菌灵的抗性菌株在病菌群体中占有相当大的比例,对多菌灵的抗性频率均达到86.0%以上,因此用此药防治该病已基本无效,起不到应有的防治作用。2.2抑菌活性测试从总体上看(图1),山西各地灰霉菌对多菌灵已不同程度产生了抗药性,但在各地区的抗性情况不相同。多菌灵总体抗性频率达到89.4%,其中中抗菌株占有相当大的比例,为39.4%,高抗菌株为50.0%,仅有10.7%的测试菌株表现为敏感。在晋中、晋东南和晋北地区,中抗菌株比例较高,均在50%以上,而晋南地区高抗菌株的比例更大,达到69.4%,表明晋南地区对多菌灵的抗性最为严重。2.3抗菌菌株的ec50,ec29多菌灵的毒力测定结果显示:敏感菌株的平均EC50值为0.0428μg·mL-1,EC90值为0.1280μg·mL-1(表2);中抗菌株的平均EC50值为11.2415μg·mL-1,EC90值为128,4351μg·mL-1(表3)。中度抗性菌株的抗性倍数为262.7倍。由于大多数高抗菌株的抗性太高,无法测得其EC50值,但实验表明,EC50值均大于50μg·mL-1,且大部分高抗菌株EC50值大于100甚至500μg·mL-1,即抗性倍数在1000倍以上。3结论和讨论3.1养菌剂的应用灰霉病菌对多菌灵的抗药性在山西省范围内普遍较严重。其中,晋南和晋东南的抗性程度相当;晋中地区轻于前二者,晋北地区最轻。根据我国对多菌灵的用药历史和药剂特性,抗性发生有一定的规律。从对山西省调查结果看,其灰霉菌的抗性与我国总体情况基本一致。多菌灵在山西省晋南、晋东南及晋中地区防治灰霉病基本已无效,在晋北应需慎重使用。3.2ec50值的变化田间的灰霉菌株对多菌灵发生抗药性突变其程度呈梯度变化,即从中低抗到高抗,其EC50值连续性增大。中抗菌株的抗性倍数为11.24倍,高抗菌的倍数则变化范围很大,且大多数在1000倍以上。抗性机理研究表明,苯并咪唑类杀菌剂的抗药性是由一个主效基因控制的,所以一旦产生突变,其抗性程度会达到很高的水平。3.3测定结果可靠性分析抗性检测结果的可靠性与采集的菌株数、菌样的代表性(即取样随机性)及测定方法三者直接相关。由于灰霉病在保护地的发生很普遍,这给监测中的采样调查带来很大便利。所以,在山西省共测定了188个菌株,得出的结果可靠性较高。相比之下,晋北地区所采得的菌样较少,所以其结论的准确性较差。特别是在该地区未检测到多菌灵的敏感菌株,并不能确定晋北地区没有此类型。3.4抗性ec50本实验中用测定MIC法进行抗药性的鉴定,这是国际上最常用的方法,操作简单而结果可靠。但国内外大量研究中,抗性鉴定方法不同。也有人按照抗性水平的普遍定义,根据