浅析甾醇侧链切除的微生物转化技术

浅析甾醇侧链切除的微生物转化技术

微生物转化一直受到针灸和莫哈药房的影响。为了使用低价天然材料进行生产原料，提高微生物转化效率一直是人们的方向。传统甾体医药生产工艺采用甾体皂甙类自然资源为原料的化学合成途径。由于自然资源的逐渐匮乏,化学合成工艺路线繁长、“三废”污染严重,上世纪60年代人们开始采用微生物转化广泛存在于动、植物体内的甾醇。如图1所示,AD(androst-4-ene-3,17-dione)和ADD(androsta-1,4-diene-3,17-dione)已成为世界市场的重大产品,每年有1000吨以上的甾醇用于ADD/AD生产。这一变革归功于筛选到了能够将谷甾醇、豆甾醇和胆固醇等动植物甾醇转化为关键中间体的微生物菌株和开发了能用于大规模工业化生产的微生物转化技术。本文综述微生物转化技术的新进展以及我们最近开发的浊点系统两相分配生物反应器技术。1有机溶剂进料法1944年,Turfitt发现Mycobacterium能利用胆固醇或植物甾醇为唯一碳源进行生长和繁殖。起初采用添加酶抑制剂的方法抑制1-2位脱氢酶或9α-羟化酶的活性,后来通过微生物诱变,获得了阻断1-2位脱氢酶和9α-羟化酶的突变株或阻断9α-羟化酶的突变株,使甾醇侧链切除的微生物转化进入了应用时期。甾醇在水中溶解度很小,甾醇侧链切除的微生物转化常常不是由酶催化反应速率控制,而是由底物的传递过程速率控制。生物转化的底物是有机物,在水中溶解度一般较小,生物转化疏水性底物是转化技术的共同问题。如图2所示,酶转化不溶性底物常采用的策略有均质有机溶剂、两相系统/乳化、两相膜生物反应器和反胶束系统等。甾醇侧链切除是多酶催化过程,必须采用全细胞转化,和酶在非水溶剂中稳定性相比,微生物在非水溶剂中的生物相容性更加复杂。早期解决甾醇侧链切除转化效率的方法是采用有机溶剂进料,如将甾醇脂质体化、二甲基亚胺饱和溶液等。由于水溶性有机溶剂的生物相容性差,培养基中有机溶剂浓度受到限制,增加底物溶解的作用难以发挥。采用添加表面活性剂等的乳浊液进料方法也得到广泛研究,如环糊精、卵鳞脂、聚氧丙烯醇、Tween80等,表面活性剂一方面增加底物的溶解度,同时也改变细胞膜的通透性,对加快底物的传递和与微生物作用应该会产生明显效果,但实际上并不理想。两相膜生物反应器和反胶束系统应用于甾醇侧链切除的微生物转化还未见文献报道。微生物转化甾醇侧链切除的效率不但受底物溶解度的影响,还受到底物、产物抑制,产物进一步降解等的制约。采用树脂等吸附剂的原位产物去除(in-situproductremoval)方法实现了解除产物抑制和保护产物进一步降解,在底物浓度达到10g/L时也获得了较高的产物得率。最近发展起来的两相分配生物反应器,萃取相不但充当底物的储存库,还充当产物的萃取剂,同时实现底物的增溶和产物的原位去除。两相分配生物反应器应用于微生物转化甾醇侧链切除的典型实例如表1所示。双水相系统因生物相容性好而被应用于甾醇侧链切除的微生物转化,但多聚物的增溶能力和价格限制了其在工业中应用。相对于水溶性的均质有机溶剂,有机溶剂两相系统的生物相容性有提高,在甾醇侧链切除的微生物转化中研究较多。但有机溶剂仍有生物相容性问题,难度仍很大。细胞固定化技术是提高微生物生物相容性的有效途经。文献报道了在有机溶剂两相系统中固定化细胞的催化活性明显高于游离细胞。文献还报道了在双水相系统中采用固定化细胞的磁悬浮方法而改变细胞在两相系统中的分配,使微生物转化效率提高。有机溶剂两相系统虽有明显的优势,但培养基中营养成分在有机溶剂中存在去极化现象,降低了微生物的生物利用度;底物在有机溶剂两相系统中高度的不均匀分配,导致发生反应的溶液相中底物浓度很低,降低了底物的反应速率;有机溶剂的挥发性,增加了环境、安全的复杂性等。甾醇侧链切除的微生物转化过程一般都是将甾醇加入微生物的转化培养基中,以甾醇为碳源或唯一碳源。这种方法的主要缺点是不能实现高细胞密度转化和生长培养基使下游分离困难。克服这一缺点的方法之一是采用休止细胞生物转化,将培养好的细胞加入营养成分缺乏的介质中进行生物转化。这一方法还能减少其它微生物污染的可能性。Cabral等在有机溶剂两相系统中研究了甾醇侧链切除的微生物转化,测定了细胞量、微生物酶活性等重要数据,为甾醇侧链切除采用休止细胞转化作了探索。甾体羟化有采用休止细胞的报道,但甾醇侧链切除是多酶催化,还少见报道。2浊点系统的开发非离子表面活性剂溶液不同于离子型表面活性剂溶液的特征之一是在一定温度或一定添加物浓度的条件下,溶液自动分相而形成表面活性剂浓度很低的稀相和富含表面活性剂的凝聚层相(Coacervatephase),稀相表面活性剂浓度大于或等于临界胶束浓度。溶液分相时的温度称为浊点,这一系统称为浊点系统(cloudpointsystem,CPS)。在分离科学领域常利用溶质在两相中不均匀分配而实现浊点萃取。采用Mycobacteriumsp.NRRLB-3683转化植物甾醇时获得主产物ADD、副产物AD和微量副产物20α-羟甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮(图3)。在一定浓度的TritonX-100和TritonX-114组成的表面活性剂溶液中,在转化培养温度和产物的诱导下表面活性剂溶液会形成浊点系统,我们将浊点系统开发为新的两相分配生物反应器技术成功地应用于甾醇侧链切除。数学模拟浊点系统中甾醇侧链切除过程确定了表面活性剂浓度是转化过程的重要可调参数,进一步优化了生物转化过程的操作参数,使胆固醇添加浓度达到14.5g/L,产物ADD和AD浓度达到10g/L以上,摩尔转化率高达93%。如图4所示,浊点系统比常规溶液系统和其它两相生物反应器有优势。在水中,产物抑制微生物转化;在双水相系统中,高溶剂价格使其工业应用不现实;在有机溶剂两相系统中,有机溶剂的生物毒性必须使用固定化细胞;在浊点系统中,不论是活细胞还是休止细胞,非固定化细胞微生物转化都能顺利进行。类似于反胶束系统,浊点系统的凝聚层相形成W/O型微观乳浊液,对疏水性底物具有增溶作用,使底物的溶解度增加,充当着底物的储存库。而且浊点系统凝聚层相的微观乳浊液是表面活性剂和水形成的,消除了有机溶剂的影响。浊点系统中生物转化液的薄层层析谱如图5,浊点系统具有一般两相分配生物反应器中底物、产物在两相中不均匀分配的特征,实现了底物的缓控释,解除了底物抑制。产物的萃取解除了产物抑制和降解。我们在浊点系统中证实了微生物转化反应和微生物细胞生长的可分离性,成功地实现了甾醇侧链切除的休止细胞微生物转化。HPLC分析活细胞转化7d和休止细胞转化4d时转化液的结果如图6所示,转化的主产物ADD、副产物AD和微量副产物20α-羟甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮的出峰时间分别为3.6min、4.3min和6.2min。休止细胞生物转化较活细胞生物转化的产物ADD浓度增加,转化周期缩短,可能是实现了高细胞密度转化所致。甾醇侧链切除形成产物ADD存在母环的△1-2脱氢反应,这是依靠辅酶催化的全细胞转化,辅酶的连续再生一般需要活细胞代谢来维持。休止细胞和活细胞生物转化的HPLC图谱基本一致,这表明休止细胞维持了活细胞的生命活力。但休止细胞和活细胞生物转化相比,副产物AD的比例降低,微量副产物20α-羟甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮量略有有升高,表明全细胞生物转化甾醇侧链切除体系有