浊点萃取液-液萃取方法的研究进展

浊点萃取液-液萃取方法的研究进展

一、高效液相色谱前处理云萃取方法（cpe）是近年来提出的一种新兴的液相萃取技术。使用具有机械溶剂不会影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础,改变实验参数引发相分离,将疏水性物质与亲水性物质分离。目前,该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中。它经济、安全、高效、操作简便、应用范围广。作为分离纯化方法,易于大规模生产;作为样品前处理方法可与高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)等后序仪器分析方法联用。本文概述了CPE的原理、操作方法,总结了CPE近年来在生物大分子的分离及分析方面的应用,讨论了与其他液-液萃取法的区别,还探讨了该法的发展前景。二、浊点提取的基础1.浊点现象—表面活性剂胶束溶液的形成和浊点现象表面活性剂分子通常由疏水和亲水两部分组成。疏水部分在水溶液中聚集成核,亲水部分向外张开形成胶束。表面活性剂在水溶液中形成胶束的最小浓度称为临界胶束浓度(CMC),最低温度称为临界胶束温度(CMT)。表面活性剂类型不同,溶液条件不同,胶束形态各异,如圆形、椭圆形、圆柱形。平时应用表面活性剂性质最多的是它的增溶作用,很多微溶于水或不溶于水的物质可以与表面活性剂结合后溶于水。CPE法除了利用增溶作用外,还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。一个均一的表面活性剂水溶液在外界条件(如温度)变化时,因为引发相分离而突然出现浑浊的现象叫浊点现象,此时的温度叫做浊点温度(CP)。静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相:一为表面活性剂相(约占总体积的5%);另一为水相(胶束浓度等于CMC)。外界条件(如温度)向相反方向变化,两相便消失,再次成为均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白,与表面活性剂的疏水基团结合,被萃取进表面活性剂相,亲水性物质留在水相,这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。温度的改变,引起水化层的破坏,增强了表面活性剂的疏水性。相分离是熵(倾向于水与胶束相溶)与焓(倾向于水与胶束相分离)竞争的结果。浊点萃取中表示表面活性剂胶束溶液浓度与浊点温度变化关系的相图,对不同体系其形状各不相同。相图上的曲线也是其两相的共溶曲线。图2A为非离子型表面活性剂胶束溶液的相图,温度-浓度曲线把图分为两部分,上部为双相区(2L),下部为单相区(L)。曲线的最低点对应的浓度与温度分别为表面活性剂的CMC和CMT。图2B为两性离子表面活性剂胶束溶液的相图,温度-浓度曲线同样把相图分为两个区域。不同的是上部为L下部为2L。这就意味着温度升高两相消失,温度降低至浊点以下,两相又出现。与非离子型表面活性剂恰好相反,两相的出现是由于温度下降而不是温度升高引发的。2.其他表面活性剂研究影响浊点萃取常用的参数包括:表面活性剂的浊点(CP)、萃取率(E)、浓缩因子(CF)和分配系数(K)。它们可用下式表示:E=CS×VS/(CO×VO)=CF×VS/VO;CF=CS/CO;K=CS/CW。其中CS为溶质在表面活性剂中的浓度,CO为萃取平衡后溶质在原始溶液中的浓度,CW为溶质在水相中的浓度,VS为表面活性剂的体积,VO为原始溶液的体积。影响浊点萃取的因素很多,简要概括如下:(1)表面活性剂类型及性质选择表面活性剂时主要考虑其两个性质:①浊点温度,尤其对于热敏感的分析物要注意操作温度对稳定性的影响;②疏水性,疏水性太强会造成蛋白质失活。表1中列出了CPE中常用的表面活性剂名称、结构和浊点温度以及它们的临界胶束参数。浊点温度与表面活性剂中亲水、疏水链长有关。疏水部分相同时,亲水链长增加,CP升高;相反,疏水链长增加,CP下降。表面活性剂浓度增加,E随之增加达到最大值。(2)添加剂的加入在生物大分子的浊点萃取中,特别是对热敏感的生物大分子,需要使用CP较低、疏水性适宜的表面活性剂。很多添加剂如电解质、有机物、表面活性剂、蛋白质变性剂等都可在很大范围内影响表面活性剂的CP,引发表面活性剂水溶液的相分离。可以加入的电解质种类很多。在非离子型表面活性剂中加入氯化物、硫酸盐、碳酸盐、叠氮化物等盐析型电解质,可使胶束中氢键断裂脱水,导致表面活性剂分子沉淀从而降低表面活性剂的CP,引发相分离。引发相分离的盐浓度与表面活性剂的疏水性有关,疏水性强需要的盐浓度低。在大多数实验中要加入NaCl,一方面降低CP温度,另外缩短相分离时间。盐浓度增加可以使E和CF提高,但要避免过高盐浓度以免对酶产生抑制作用。但加入硝酸盐、碘化物、硫氰酸盐等盐溶型电解质,作用相反,可以使CP升高。离子强度对E、K、相体积无明显影响,但是离子强度可以改变水相密度,便于两相分离。与水完全混溶的极性有机物如脂肪醇、脂肪酸、苯酚能使非离子型表面活性剂的CP降低。多元醇如葡萄糖、蔗糖、丙三醇,水溶性聚合物如聚乙二醇(PEG)、环糊精,也可以降低CP;聚合物使CP降低的效果既与浓度有关,也与分子量有关。丙三醇、蔗糖经常用于稳定蛋白质,可用来防止不稳定蛋白质的变性。Werck-Reichhart等在从植物微粒体中萃取细胞色素b5和P450中加入丙三醇降低了表面活性剂的CP。短链饱和烃类降低CP不太显著,而更多的可溶于胶束的非极性有机物使CP升高。蛋白质变性剂(尿素、硫脲衍生物等)使CP升高。阴离子型表面活性剂和其它水溶助剂(hydrotrope,如甲苯磺酸钠),也使CP升高。对于两性型表面活性剂,添加剂的作用与非离子型表面活性剂的情况完全相反。(3)混合型表面活性剂使用混合表面活性剂也可以在一定范围内控制浊点温度。如TritonX-114/TritonX-45,可以在0—22℃内根据表面活性剂比例不同而任意调节CP。它们的关系可用下式表示:CP(℃)=21.4-1.23w(w为TritonX-45的质量百分含量)。Minuth等报道了使用混合型表面活性剂代替纯的C12E5表面活性剂萃取胆固醇氧化酶(CHO)。使用氧乙烯基团窄分布的聚氧乙烯表面活性剂混合物C12E5/C14E6、C14E5/C14E6、C12-18E5,得到较好的萃取率且降低了成本;而氧乙烯基团宽分布的聚氧乙烯表面活性剂混合物C12E4/C14E4、C12E5/C14E5、C12-18E5的CP过高,难以引发相分离。Chiang等分别用C12E4/C12E5和C14E5/C14E6混合表面活性剂CPE分离胆固醇脂酶。他们还分别计算出CP与混合物中短氧乙烯基的表面活性剂质量百分比的关系为CP(℃)=20.75-0.309w和CP(℃)=32.82-0.243w。(4)pH的影响pH是影响生物大分子性质的重要参数之一。在等电点附近时,蛋白质的疏水性最强,最适合于进行浊点萃取,而且得到的E、K也是最大。偏离等电点后,疏水性减小,萃取过程的E、K都随之下降。3.胶束与水溶液蛋白质的相互作用Blankschtein等人在研究CPE过程中,发现亲水性蛋白质的K<1,而在通常的CPE中,被萃取物的K>>1。他们提出了亲水性蛋白质与胶束的体积排阻理论。发现非离子型表面活性剂(C10E4)在水溶液中自聚成圆柱形胶束,形成网状结构,网眼大小远大于蛋白质。胶束与水溶性球蛋白的相互作用如同两个互不缔合的实体发生近距离排斥和体积排阻的作用。该作用与蛋白的大小、形状有关。典型的亲水性球蛋白的半径在1.5—5nm间,它们的分配系数在0.85—0.4之间,相分离后亲水性球蛋白留在水相。他们应用该理论预测了大小不同的几种亲水性蛋白质(细胞色素c、大豆胰蛋白酶抑制剂、卵清蛋白、牛血清白蛋白、过氧化氢酶)分别在C10E4胶束及C8-lecithin胶束中的分配系数,预测的分配系数与实验值吻合。作者还预测了几种病毒:噬菌体ΦX174,P22,T4在C10E4胶束中的分配系数,比实验值略大。4.peo-ppo嵌段基层聚合物的分离和分离CPE法与双水相体系类似,都可以用于生物大分子、有机物及金属离子的萃取。双水相体系通常使用PEG/葡聚糖或PEG/盐体系,但前者原料价格昂贵,后者对于两亲性蛋白质溶解性较差,使蛋白易留在水相。相分离后聚合物与蛋白质也较难分离。而CPE法表面活性剂用量较少,价格便宜,体系组成简单,并且表面活性剂与蛋白质容易分离,便于回收再利用。由PEO-PPO嵌段共聚物(如pluronic)或EO-PO无规共聚物(如UCON)组成的液-液萃取系统与中性表面活性剂的CPE法也十分类似。共聚物溶液也是在升温至CP点后相分离,PEO-PPO嵌段共聚物也形成胶束溶液再分相,并且它可以先与羟丙基淀粉或葡聚糖组成双水相系统,分离后共聚物相升温至CP再次相分离。该体系也可用于生物大分子的分离。有的学者认为它属于CPE发展的一个新方向;另一些学者认为它自成一个体系称之为热分离聚合物体系(TPS),在此不作详细讨论。三、表面活性剂相的设置Bordial最早将CPE应用于生物学领域,其操作步骤较简单,无需使用专门仪器。密度不同,表面活性剂相对水相的位置也不同。表面活性剂相通常为液态,且粘度较大(η≈20cP)。所以,有时要在表面活性剂相中加入少量的溶剂来稀释它,而且可用表面活性剂多次萃取水相。此后,很多人对这种基本操作法做了修正,如用蔗糖溶液作为缓冲物分隔表面活性剂相与水相;低温下(-20℃)将样品与表面活性剂培养24h,使疏水性极强的蛋白质沉淀。1.高效液相萃取法CPE法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体,还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步,与色谱方法联用。另外,CPE法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。虽然他们的方法耗时较长(约20h),但是投资少、劳动强度低,萃取效率及浓缩因子与实验室制备结果类似。使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行。但商品离心分离器用于CPE的效率和容量仍需进一步研究。另外,他们发现相分离操作受细胞培养时产生的表面活性物质影响较大。还有,体系两相间密度差较小,表面张力较小,含产物的表面活性剂相的流变学行为较复杂,操作较难。表2列出了CPE法近几年来在蛋白质分离纯化中的应用。(1)膜蛋白的分离纯化膜蛋白(内嵌膜蛋白、外围膜蛋白)疏水性强、难溶于水,抽提内嵌膜蛋白时,既要削弱它与膜脂的疏水性结合,又要使它保持疏水基在外的天然状态,较难分离纯化。由于表面活性剂具有两亲性,它一直作为膜蛋白理想的增溶剂。增溶时,膜蛋白疏水部分嵌入胶束的疏水核中而与膜脱离,又保持了膜蛋白表面的疏水结构。相分离后,膜蛋白与表面活性剂共同析出,与亲水性蛋白质分离。所以,CPE法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。已经成功地分离出乙酰胆碱脂酶、噬菌调理素、细菌视紫红质、细胞色素c氧化酶等内嵌膜蛋白。有一些蛋白在表面活性剂/水两相间的分配比较反常。如一种管形内嵌膜蛋白:乙酰胆碱受体在CPE体系中分配在水相。由于这种受体疏水部分不规则,很难与TritonX-114的疏水基团相互作用;而在体系中加入带有线形烷基链的亚麻油酸,乙酰胆碱受体可被萃取入表面活性剂相。另外,内嵌糖蛋白上的糖含量较高,在少量TritonX-114(0.06%)存在下,它们也表现为亲水性。(2)tri能力分离CPE在分离植物蛋白如多酚氧化酶(PPO)、酪氨酸酶时,其体系中的酚类化合物(如鞣酸)和叶绿素可与TritonX-114形成褐色沉淀除去。解决了传统方法硫酸铵分级法、丙酮粉末法处理时出现的多酚与酶结合,叶绿素干扰酶活性等问题。CPE法较温和,不会改变活性潜伏的酶的结构,如在分离活性潜伏的酪氨酸酶时,保留了二酚酶和酪氨酸酶的潜伏活性。现在已经成功地用该法分别从植物的根、叶和果实中分离出多酚氧化酶。(3)糖液萃取成分的选择一般的CPE只能根据蛋白质的疏水性不同进行分离。在表面活性剂中引入亲和配体或使用亲和衍生表面活性剂,可以选择性地将亲水性蛋白质萃取入表面活性剂相中。Saitoh等第一个报道了在两性型表面活性剂C9APSO4中引入疏水性的亲和试剂分别萃取亲水性的抗生物素蛋白及己糖激酶。而加入亲和试剂TritonX-114却不能有效地萃取出这两种亲水性蛋白质。还有使用TritonX-114-汽巴蓝络合物纯化哺乳脱氢酶。另一篇报道中,使用C10E4-丙氨酰丙氨酸衍生胆固醇亲和标记物络合浊点萃取了万古霉素。若体系中引入带电的表面活性剂或聚合物,还可以根据蛋白质的带电不同加以分离。Sivars等在C12E5/葡聚糖中分别引入阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及葡聚糖硫酸盐,研究了净电荷不同的亲水性蛋白质(BSA、乳球蛋白、肌红蛋白、细胞色素c和溶菌酶)在这4种体系中的分配。结果发现,这5种亲水性蛋白质由于与带电的聚合物的排斥作用或带电的表面活性剂的吸引作用,被萃取入表面活性剂相。蛋白质的净电荷、体系pH值、带电表面活性剂浓度显著影响亲水性蛋白质在两相中的分配。另有报道,用TritonX-114/阴离子葡聚糖硫酸盐(Dx-S)从猪肝的微粒体中分离纯化细胞色素b5。加入Dx-S后,微粒体的萃取率显著下降,而细胞色素b5的萃取率上升。浓缩因子和萃取率与DEAE-纤维素柱分离效果相当。CPE法可以作为色谱分离细胞色素b5前的预纯化步骤。在该领域的另一发展是使用烷基葡糖苷表面活性剂代替聚氧乙烯表面活性剂与水溶性聚合物(如葡聚糖、PEG)结合,在0℃左右引发相分离,使疏水物质和亲水物质分离。Triton系列的表面活性剂由于其较强的疏水性与较低的纯度易使蛋白质失活,而用辛基葡糖苷/聚合物则不易使蛋白失活。如用辛基β-D硫葡糖苷与PEG或葡聚糖几乎可以定量萃取细胞色素P450和b5。用烷基葡糖苷/水溶性聚合物体系还有其它优点:通过控制聚合物的类型和浓度可在任何温度引发相分离,还可在聚合物上结合一定官能团控制某疏水蛋白的萃取效率。这种CPE适用于不稳定蛋白,可在0—4℃下进行低温操作,同时烷基葡糖苷的临界胶束浓度较大,可以通过滤膜分离蛋白和烷基葡糖苷。2.cpe在生物分析中的应用(1)蛋白修饰及酶催化作用生物分子在表面活性剂/水两相体系中的分配主要是依据其表面所具有的亲水性疏水性基团。所以,CPE法也可以用来表征蛋白质。首先,可以通过目标蛋白在表面活性剂中的萃取效率来判断蛋白质是否为内嵌膜蛋白。第二,改变pH、引入配体和酶后,可通过观察蛋白质在两相间分配的变化了解其构象变化,来研究翻译表达后蛋白修饰及特定体系中蛋白-蛋白间作用力大小。蛋白激酶C-α与精氨酸多肽底物结合后在表面活性剂相中的萃取率明显提高。这说明与底物结合后,酶的疏水部分暴露得更多了。CPE法也可以考察pH引发的溶酶体糖蛋白——皂角苷(Sap)的构象变化。在中性条件下,A、B、C和D4种类型的Sap都分配进水相;当pH值降低,SapA、C和D都被萃取进表面活性剂相,说明它们的疏水性部分暴露出来,只有SapB保留在水相。用这种方法也可以研究腺病毒蛋白、脊髓灰质炎病毒、羧肽酶E、流感病毒红血球凝集素、内涵蛋白、网格蛋白及一些毒素在pH改变后构象的变化。(2)将萃取物与表面活性剂分离CPE可以作为高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)、毛细管电泳(CE)等仪器分析的样品前处理方法,提高检出灵敏度。表面活性剂可以防止样品吸附在玻璃容器上,易于与FIA中的载液及HPLC中的有机流动相或胶束流动相混合,可以直接进样。但是在很多应用中需要除去表面活性剂后再与仪器联用。将萃取物与表面活性剂分离的方法很多。对于CMC>1mM的表面活性剂如两性离子表面活性剂可用透析法,但操作时间较长(24h左右)。对于CMC较小的表面活性剂可通过色谱柱分离除去,如凝胶柱、毛细管柱等,分离出的表面活性剂可以再利用,也可以用废丙酮焚烧处理。但CPE作为HPLC的样品前处理方法有两个缺点:第一,常用的表面活性剂在UV区域有很强的背景吸收。为克服这一弊端,可以改变检测方式,如采用电化学检测器或荧光检测器;还可选用在UV检测区无吸收的表面活性剂如两性离子表面活性剂或CnEm型表面活性剂。第二,操作时间较长,从色谱柱上需用几个小时洗脱表面活性剂。表面活性剂的洗脱可