链脲佐菌素诱导的糖尿病模型鼠胰岛细胞的损伤机制

链脲佐菌素诱导的糖尿病模型鼠胰岛细胞的损伤机制

在本实验中，我们以链佐细菌素（stz）为研究对象，以1型糖尿病模型大鼠（t1dm）为研究对象，通过野外实验，将具有相同通性的小鼠正常胰岛细胞与模型小鼠脾脏淋巴结混合，观察同性同性大鼠正常胰岛细胞的损伤，并探讨了stz模型小鼠胰岛细胞的损伤机制。为深入研究1型糖尿病的发病机制和治疗策略提供了基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1c型实验动物，7周龄，纯度雄性，18株苍鹭，2g，采集材料1.1.2仪器、试药和mttSTZ:sigma公司产品;v型胶原酶:北京泽平科技公司;血糖试纸:德国罗氏公司;尿糖试纸:迪瑞公司;胎牛血清(FCS):Invitrogen公司产品;MTT:sigma公司产品;胰岛素试剂盒:美国佰尔公司。1.1.3血糖仪accu-chckacifACS180型全自动免疫分析仪:美国佰尔公司;血糖仪(ACCU-CHCKActive):德国罗氏公司;酶标仪(InterMedNJ-2100)。1.2方法1.2.1mtt比色法检测胰岛细胞受损情况小鼠颈椎脱位处死,无菌分离胰岛细胞,调细胞浓度至1×106个/ml,加入96孔细胞培养板,每孔200μl,再分别加10μl不同浓度的STZ-枸橼酸盐缓冲液0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml(相当于体内实验40mg/Kg)、1.6mg/ml体外混合培养48h,对照组每孔加入与STZ等量的pH4.00.01M的枸橼酸缓冲液,设3复孔,采用MTT比色法测OD值来显示胰岛细胞受损情况。1.2.2血糖检测及模型的制作枸橼酸钠缓冲液(0.01mol/l,pH4.0)配制成0.4%STZ溶液,40mg/Kg腹腔注射,每天1次,连续5天,每周分别测空腹血糖(末梢全血快速血糖测定法:剪尾取血,血糖仪检测)1次,动态监测1型糖尿病模型形成,以血糖≥11.4mmol/L持续2周为模型制作成功,低于此值弃去。所有实验小鼠均在标准环境下饲养,自由饮食、饮水,不限量,喂养4周。1.2.3外观模型中，大鼠脾淋巴结对正常大鼠胰岛细胞的损伤1.2.3.1.模型大鼠和普通大鼠脾脏淋巴结的制备分别无菌制备模型鼠与同系正常鼠的脾淋巴细胞(未纯化,含有单核-巨噬细胞,以下同)的浓度分别为5×106/ml和5×107/ml备用。1.2.3.大鼠脾淋巴细胞培养将无菌分离的正常鼠胰岛细胞重悬细胞浓度为1×106/ml,加入96孔培养板,每孔100μl,每组设3复孔。不用STZ致敏。实验组取上述制备模型鼠脾淋巴细胞5×106/ml和5×107/ml两个浓度的脾淋巴细胞每孔分别加100μl与正常鼠胰岛细胞混合培养。采用同系正常鼠脾淋巴细胞5×106/ml和5×107/ml两个浓度作为对照组。置37℃5%CO2恒温培养箱中孵育。分别于72h、144h、216h,应用MTT法检测OD值,观察胰岛细胞受损程度。1.2.3.胰岛细胞培养将0.2mg/mlSTZ10μl与分离的正常鼠1×106个/ml的胰岛细胞100μl混合培养于96孔培养板24h。然后,再将模型鼠和同系正常鼠的脾淋巴细胞100μl加入各孔,其余步骤与1.2.3.2相同。1.2.3.胰岛细胞培养将0.2mg/mlSTZ10μl与分离的正常鼠1×106/ml的胰岛细胞100μl混合培养于96孔培养板48h。然后,再将模型鼠和同系正常鼠的脾淋巴细胞100μl分别加入各孔,其余步骤与1.2.3.2相同。1.2.3.5-胰岛素测试吸出上述各实验组和对照组每孔中的上清液,采用全自动免疫分析仪(化学发光原理)检测胰岛素的分泌量。1.3统计处理采用SPSS11.5统计软件进行统计分析,实验数据均以表示,组间比较采用t检验。2结果2.1不同剂量的stz对外囊细胞的影响将不同浓度的STZ-枸橼酸盐缓冲液和正常Balb/C小鼠的胰岛细胞混合培养48h后,胰岛细胞受损,数量有不同程度下降,详见表1。2.2不同大鼠胰岛细胞损伤情况将模型鼠脾淋巴细胞分别与无STZ致敏组和STZ致敏组的同系正常鼠胰岛细胞混合培养,培养72h、144h、216h胰岛细胞的损伤情况3stz对胰岛细胞自身免疫损伤的作用国内外大量的实验研究表明T1DM的发病机制主要是由于Th1细胞介导细胞免疫应答破坏胰岛β细胞,在T1DM后期,逐渐转为Th2细胞介导的体液免疫应答,对Th1细胞产生抑制作用,使对胰岛细胞的破坏具有减轻作用。一旦T细胞凋亡发生障碍,未被清除而存活下来,在一定条件下就会发生自身免疫性疾病。已有研究结果显示,以小剂量多次注射STZ的方法建立的1型糖尿病动物模型更接近于人类1型糖尿病发病过程。本实验通过体外实验进一步证明了STZ诱导1型糖尿病的发生机制。以0.2mg/mlSTZ与正常Balb/C小鼠的胰岛细胞混合培养后,胰岛细胞损伤与对照组比较无明显变化(P>0.05),可用于体外胰岛细胞致敏;以0.4mg/mlSTZ或0.8mg/ml(40mg/Kg)STZ与正常Balb/C小鼠的胰岛细胞混合培养后,胰岛细胞有轻度损伤(P<0.05);以1.6mg/ml(80mg/Kg)STZ与正常Balb/C小鼠的胰岛细胞混合培养后,胰岛细胞损伤非常明显(P<0.01)。由此推论,大剂量的STZ对胰岛细胞具有直接的细胞毒作用;低剂量的STZ对胰岛细胞没有明显的细胞毒作用。这与刘阳研究的体内STZ诱导的1型糖尿病模型鼠的STZ剂量基本一致。当小剂量使用STZ时,它可以通过激活免疫学机制导致胰岛β细胞的失代偿性病理损伤;而当一次大剂量使用时,则可以通过DNA烷基化的机制导致胰岛β细胞的不可逆的病理损伤。通过采用多次腹腔注射STZ的方法,诱导1型糖尿病小鼠模型,血糖明显增高。体外观察模型鼠脾淋巴细胞对同系正常鼠胰岛细胞的损伤作用,实验结果显示,随着培养时间的延长,在脾淋巴细胞浓度为5×106个/ml组,无STZ致敏组、24hSTZ致敏组和48hSTZ致敏组的胰岛细胞损伤及胰岛素的分泌量与其各自对照组比较基本无明显变化。而在脾淋巴细胞浓度为5×107个/ml组中,体外培养72h,无STZ致敏组和24hSTZ致敏组与其各自对照组比较胰岛细胞的损伤及胰岛素的分泌量具有明显差异(P<0.05);48hSTZ致敏组与其对照组比较胰岛细胞的损伤及胰岛素的分泌量具有显著差异(P<0.01)。体外培养144h和216h,无STZ致敏组、24hSTZ致敏组和48hSTZ致敏组与其各自对照组比较具有显著的差异(P<0.01)。可见,启动胰岛细胞自身免疫性损伤的发生与同系1型糖尿病模型鼠激活的脾淋巴细胞数量及STZ致敏胰岛细胞的次数和历时有关,同时,还与混合培养的天数密切相关,这与邹晓蕾等研究的T细胞过继转移致糖尿病发生的结论基本一致。模型鼠脾淋巴细胞可以损伤未经低剂量STZ致敏的同系正常鼠胰岛细胞,证明模型鼠脾淋巴细胞最终可以诱发胰岛细胞损伤;模型鼠脾淋巴细胞可加强损伤低剂量STZ致敏的同系正常鼠胰岛细胞,可以推论细胞毒性T细胞(CTL)只识别STZ改变的胰岛细胞,并加速其破坏,同时也说明随着小剂量STZ的累积可以使胰岛细胞的抗原特征改变,使得其成为与胰岛细胞抗原类似的非己抗原而启动了免疫应答,对胰岛细胞发生交叉性的免疫攻击,在胰岛细胞对STZ引发的自身免疫损伤未及代偿时,模型鼠激活的脾淋巴细胞即引起胰岛细胞的免疫损伤,导致胰岛细胞进一步破坏和失去分泌胰岛素的功能。证明了小剂量的STZ作为胰岛细胞自身损害的诱因使自身免疫性T淋巴细胞逐渐加重胰岛细胞损伤。因此,用小剂量的STZ处理易感动物导致胰岛细胞的持续性破