正交设计法优化黄体酮缓释栓的处方

正交设计法优化黄体酮缓释栓的处方

由于合成激素的许多副作用，天然黄酮补充剂仍然是治疗黄土不健康的最有效方法。已有相关报道寻求一些改进的剂型和给药途径,如口服、肌内注射、阴道给药、鼻腔给药、经皮给药和直肠给药等。其中,黄体酮阴道栓因其吸收良好,给药方便的特点,在临床上已广泛应用。但它存在着两大缺点,即血清孕酮水平低,维持时间短;而直肠栓经吸收后约有50%～75%的药物可不经肝脏而直接进入体循环,可避免肝脏首过效应,从而减少给药次数;同时又克服了阴道栓吸收受黏性分泌物影响的缺点。为此,我们研制了黄体酮缓释直肠栓。1仪器和药品1.1s-133酶标免疫分析法ZRS-8型智能溶出试验仪(天津大学无线电厂);UV751GD紫外分光光度计(上海分析仪器总厂);胶体磨(型号JMS-130,温州市霸威食品机械有限公司);Serozyme-I型酶标免疫分析仪(三波长同时检测492,550,630nm,程序编辑,曲线绘制微机处理机,打印输出);磁性分离器和振荡器(深圳新产业生物医学工程有限公司);ProgesteroneSerozyme试剂盒(意大利BiochemImmunosystems,批号960600)。1.2黄体酮缓释肠栓黄体酮(progesterone)原料药(纯度99.8%,湖北制药厂,批号20000705);黄体酮缓释直肠栓(testedformulation,规格50mg,黄体酮含量为标示量的97.2%,自制);妇康宁栓(referenceformulation,上海医工和益药业有限公司,规格25mg,黄体酮含量为标示量的96.4%,批号980301)。2制备工艺2.1处方的选择2.1.1剂量及剂量的确定临床上所使用的25mg普通栓剂已能提供治疗浓度范围的血清黄体酮水平,有报道建议栓剂剂量宜4～5倍于肌注量,并应每12h给药一次,本研究将含药量定为一重要因素。采用正交试验设计方法考察处方组成中基质种类、阻滞剂卡波姆含量、含药量等对缓释栓体外释放度的影响。各因素分别选用两个水平,见表1。2.1.2peg-400研磨法因黄体酮具脂溶性,表2中四种处方的制备工艺,1与2同,用第一法;3与4同,用第二法。第一法:取PEG-4000和PEG-400的混合物(w/w=7∶3)加热熔化(50～60℃),置胶体磨研磨,加入黄体酮、卡波姆后继续研磨10min,灌模,待冷却后起模即得。第二法:取脂溶性基质36型混合脂肪酸甘油酯加热熔化(50～60℃),加入黄体酮使溶解,置胶体磨中研磨,加入卡波姆后研磨10min,灌模,待冷却后起模即得。2.1.3药物动力学检测以下L4(23)安排实验。以释放度作为指标,用“2.2”项所述方法进行测定,拟寻找最优处方作为受试制剂,与普通栓(参比制剂)作比较,并对其药物动力学进行考察,观察受试制剂是否具有缓释特征。见表2。2.2外释放率测定2.2.1波长选择根据主药和辅料的紫外吸收图谱,选择241nm为测定波长,辅料在此波长处无吸收。2.2.2标准曲线方程用纯化水配成浓度为5,10,15,20,25,30mg·L-1的黄体酮系列浓度的溶液,于波长(241±1)nm分别测定吸收度A值,将A与C进行线性回归,得标准曲线方程:C(mg·L-1)=0.0481X+0.0117(n=6,r=0.999),线性范围在5～30mg·L-1。2.2.3供试品溶液的制备本试验采用对照品法,参照中国药典2000年版二部转篮法进行体外溶出试验,具体操作如下:溶出递质为浓度5‰十二烷基硫酸钠溶液,温度37℃,转速100r·min-1,于系列时间点精密量取样液5mL,滤过,同时补充等量同温递质。取续滤液2mL置10mL量瓶中,加溶出递质稀释至刻度,即得供试品溶液。同前法分别测定供试液和对照品溶液的A值,通过对照法计算得供试品溶液浓度。2.3加样制剂选择参照中国药典2000年版中附录XIXD有关规定,缓释制剂末端取样点释放量要求75%以上,才能说明释药基本完全。从表2可见,最优处方为A1B1C1,恰好与处方1相同,因此选择处方1作为受试制剂。受试制剂处方:黄体酮5g,卡波姆1.45g,PEG-400098g,PEG-40042g,按“2.1.2”项下方法操作,共制成100粒。参比制剂15min、30min和1h黄体酮累积释放度分别为27%～36%,57%～66%,96%～99%;受试制剂1,2,8h黄体酮累积释放度分别为51%～57%,66%～71%,91%～96%。与参比制剂相比,受试制剂有明显的缓释特征,其体外溶出累积百分率Fr对时间t作图,所得Fr-t曲线见图1。3生物样品分析的建立3.1检测血酸酯类抗体样品的制备(1)洗涤液由14.3mL用去离子水稀释至200mL,配成应用洗涤液。(2)标准品、质控和标本各加60μL,然后加碱性磷酸酶标抗原30μL,加荧光素标抗体30μL,混匀后置37℃水浴孵育15min。(3)加连有磁微粒的抗荧光素抗体60μL,混匀后置37℃水浴孵育10min,于磁分离器上分离4min后,倒去上清。(4)加洗涤液300μL,混匀后置磁分离器上分离4min,去上清液。依法重复操作一次。(5)加底物磷酸酚酞90μL,另外准备一只试管只加底物作空白管,混匀,37℃水浴孵育10min。(6)加入终止液300μL(含空白管),混匀后置上磁分离器分离,10min后比色(空白管调零)。3.2测定的确证3.2.1标准曲线的线性回归浓度为0,0.5,1.0,5.0,10,40μg·L-1的标准液依上法操作所得吸光度(A)经对数转换后,对浓度进行线性回归,得回归方程为:Y=-0.0199X-0.0933(r=0.998,n=6)。3.2.2灵敏度和检出限以兔血清样品为研究对象。由于该方法为竞争性酶联免疫反应,待测样品药物含量越低,显色越好,因此该方法有灵敏度高的显著特点,最低检测限接近于0。3.2.3黄体酮标准液的测定同时将浓度为2.5,10.0,40.0μg·L-1的黄体酮标准液,以吸收度A为指标,测定日内和日间变异。结果表明:日内RSD为3.3%～7.1%(n=5),日间RSD为4.0%～9.1%(n=5)。3.2.4回收实验检测配制终浓度为2.5,10.0,40.0μg·L-1的黄体酮标准液,进行回收实验检测。结果表明:相对回收率为93.7%～100.4%。4药房与动态研究4.1血药浓度检测按随机交叉的原则将6只家兔分为2组,分别给予2.75mg·kg-1的受试制剂与参比制剂,隔一定时间耳缘静脉取血,按上述“3.1”项下操作方法测得两制剂的血药浓度。血药浓度-时间曲线见图2。从血药浓度-时间曲线可看出:直肠给药给予两种制剂后,药物吸收很快,血中5min即可检测到药物,特征与静脉给药十分类似。受试制剂达峰时间略迟于参比制剂;受试制剂峰浓度明显低于参比制剂,但下降速度较慢,具有缓释特征。4.2药动学参数分析所得血药浓度-时间数据分别用3P97程序进行拟合,采用Aikaike(AIC)信息标准为拟合度指标进行判断。结果表明,受试制剂体内过程具有二房室一级动力学特征。Cmax、t1/2、tpeak和AUC0-24h等药动学参数参照中国药典2000年版二部,采用非房室模型法进行处理,其中:Cmax、tmax为实测值,t1/2按0.693/z求出。z是末端消除速度常数,用对数血药浓度-时间曲线末端直线部分斜率求得。结果见表3。4.3生物利用用梯形法求得两制剂的血药浓度-时间曲线下面积(AUC),数据见表3。缓释栓的相对生物利用度为110.2%。4.4生物等效性检验将Cmax和AUC0-tn经对数转换后进行方差分析和双单侧t检验,tpeak进行非参数秩和检验,方差分析结果为:单次给药后,受试制剂与参比制剂间差异无显著性(P>0.05);双单侧t检验结果为:两制剂Cmax不具生物等效性,AUC0-tn具有生物等效性。由于受试制剂为缓释制剂,而参比制剂为普通制剂,二者吸收程度生物等效,Cmax有所降低,tpeak有所延长,这与4.1中释药特征相符和,从而进一步说明受试制剂有缓释特征。5讨论5.1降低释放百分率正交实验中可以看出:采用脂溶性基质的处方8h后累积释放百分率都很低(<20%),脂溶性较大的药物混悬在水溶性基质中,能降低药物在基质中的残留量,获得较完全的释放与吸收。黄体酮脂溶性大,以选择水溶性基质为宜。5.2表达总蛋白t-pcr活性测定磁性分离酶联免疫分析法是将竞争性酶联免疫分析系统与磁性微粒分离技术相结合的一种测定法。用ALT标记的抗原(衍生物)和标本抗原(P)竞争性的与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的P抗体结合,形成酶标抗原-FITC标记抗体的复合物,再加入磁性分离剂(含有与抗FITC结合的磁性微粒),使复合物与磁性微粒结合,在永久磁铁吸引下,使其沉淀至管底。分离碱性磷酸酶标抗原,加入底物磷酸酚酞PMP,ALT催化PMP水解释放出酚酞,在pH10.5的缓冲液(终止液)中呈粉红色,再以永久磁铁吸引磁性复合物使其沉淀,上清液置Serozyme-I型酶标免疫分析仪测定吸收度A值。由于标本中待测物与酶标记物都是抗原,而成色与酶标抗原量成正比,因此与标本量成反比。5.3磁酶免疫分析技术的优点与酶联免疫法相比,分离完全而快速;与放免法相比,避免了放射性物质污染;与色谱法相比,灵敏度高,无需预处理等优点。5.4抗酶反应中的抗酶反应兔与人黄体酮抗原决定族不同,种属之间无交叉抗原-抗体免疫反应。而小鼠与人黄体酮抗原决定族相同,因而有免疫反应发生。5.