海桐叶乙醇溶液提取物对4种受体植物幼苗生长的影响

海桐叶乙醇溶液提取物对4种受体植物幼苗生长的影响

0关键植物的活性成分化学处理的广泛发展和使用极大地提高了农业生产的效率，但导致污染和抗虫性杂草等问题。因此，有必要找到能够高效、低毒、适合环境的杂草活性物质。目前,从生物中寻找具有除草活性的天然产物并加以开发利用已成为该研究领域的热点之一,其中,植物作为生物活性化合物的天然宝库倍受瞩目。有研究表明,植物在其生长过程中会产生许多具有农用除草活性的次生代谢产物(化感物质),为研究开发除草剂提供了很好的材料。在众多的植物当中,园林植物海桐[Pittosporumtobira(Thunb.)Ait.]令人关注。该植物又名海桐花、山矾,为海桐花科海桐花属常绿小乔木或灌木,高达3m,其根、叶和种子均能入药。其中,根能祛风活络、散瘀止痛,叶能解毒、止血,种子能涩肠、固精等。而且,海桐皮的提取物尚具有一定的抗病毒及抗肿瘤活性,其植株粉末还具有一定的灭螺活性。此外,刘云国等发现,海桐叶片挥发性物质对大肠杆菌、白葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌具有较好抑菌作用。Suegirev等发现,海桐叶子的皂甙粗提物具有抑菌活性。王霞等的研究表明,该植物的根、茎、叶、果实和果柄5种器官对生菜和小麦幼苗的生长均具有较强的抑制作用,尤以叶器官的活性最高,该器官对夏至草、反枝苋、荠菜和黄瓜4种受体植物幼苗的生长也具有较强的抑制活性。为了找到海桐中除草活性物质的提取分离方法,笔者以活性最高的叶器官为供试材料,以乙醇溶液为提取剂,以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇为萃取剂,对活性物进行了提取及萃取试验,以期为活性物质的提取分离及进一步开发植物源除草剂提供参考。1材料和方法1.1t.[叶海桐[Pittosporumtobira(Thunb.)Ait.]叶于2009年9月采于青岛市城阳世纪公园。将采集叶片置阴凉处干燥后,用电动万能粉碎机(FW100型,转速24000r/min,天津市泰斯特仪器有限公司)粉碎,取过40目铁筛的粉末备用。1.2种种种生菜(LactucasativaLinn.var.ramosaHort,抗热绿湖黑核西生菜特选种388,蔡兴利国际有限公司,美国)、小麦(TriticumaestivumL.,‘烟农24号’)、夏至草[Lagopsissupine(Steph.)IK.-Gal.]和稗草[Echinochloacrusgalli(L.)Beauv.]。杂草种子均采摘于青岛农业大学校园。1.3样品准备1.3.1提取和处理活性物质1.3.2干燥、干燥将乙醇溶液提取物用10倍量(w/v)蒸馏水溶解后,依次用等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,将各萃取相(含水层)减压浓缩后干燥备用。生物活性测定时,将各萃取相干物质分别用DMSO溶解后吸取不同剂量的溶液直接加入琼脂溶液中分别配制成浓度为0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、1g/L和5g/L的100mL含毒基质,基质的分注方法和琼脂最终浓度同上,各处理(含空白对照)中DMSO的最终浓度为1.0%,该浓度对受体植物的生长无影响。1.4人工气候箱的制备研究的生物活性测定参照罗小勇等提出的琼脂混粉法进行。将受体植物种子经0.2%次氯酸钠溶液浸泡15min后,用自来水冲洗数次并置流水下浸泡吸水3~5h,而后用蒸馏水洗涤数次,均匀摆放在带盖方盘内的吸水纸上,滴加蒸馏水至种子不漂浮,遮光置于全智能人工气候箱(HP1000GS-B型,武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内发芽,待胚根(或种子根)达3~5mm时移植至混有不同浓度提取物或萃取物的0.5%琼脂凝胶上,以蒸馏水或含有1.0%DMSO的水溶液为空白对照。移植时先用尖嘴镊子在已凝固的琼脂表面插5个小孔,而后分别夹取胚根长度基本一致的预萌发受体植物种子,将胚根垂直由小口轻轻植入琼脂凝胶中。每烧杯5粒,重复3次。为防止光照对化合物及植物种子根生长的影响,将各烧杯放入人工气候箱遮光培养3~4天,其中,生菜和小麦为3天,夏至草和稗草为4天。人工气候箱的设置条件为14h(25℃)和10h(20℃)的自动循环,箱内的相对湿度为60%。待处理结束后,用电子游标卡尺分别测量受体植物幼苗胚根(或种子根)和胚轴(胚芽鞘)的长度,其中小麦种子根测定已长出根的总长。1.5生长量的测定计算胚根(种子根)和胚轴(胚芽鞘)的实际生长量,应用Excel软件,以生长量为基数,分别计算海桐叶器官乙醇提取物和不同萃取物对受体植物胚根(种子根)和胚轴(胚芽鞘)生长的抑制率以及对样本的标准误差。同时应用SPSS软件以LSD法对获得的抑制率进行差异显著性分析,并计算有效中浓度(EC50)。生长量=处理后的胚根(胚轴)长-处理前的胚根(胚轴)长;抑制率=[(对照生长量-处理生长量)/对照生长量]×100%。2结果与分析2.1植物种选择对胚根、胚轴的生长和抑制率从4200g海桐叶中共提取得到乙醇溶液提取物干物质720g,计算收率为17.1%。进而测定了该提取物对生菜、小麦、夏至草和稗草4种受体植物幼苗生长的影响(图1)。可见在0.02g/L的最低供试浓度下对生菜和小麦幼苗的生长均已表现出一定的抑制作用,并随浓度的增加抑制活性依次提高,至0.87g/L和1.74g/L时对2种受体植物胚根(种子根)、胚轴(胚芽鞘)的抑制率分别达生菜74.9%(41.0%)和86.9%(58.1%),小麦65.2%(27.9%)和76.7%(42.3%);对夏至草而言,在0.02g/L和0.09g/L的低浓度下只对胚根的生长显示了一定的抑制作用,对胚轴则表现出轻微的促进,此后随着浓度的增加对二者的抑制作用也随之提高,在0.17g/L、0.87g/L和1.74g/L时的抑制率分别达43.0%(2.0%)、87.1%(39.9%)和99.5%(78.0%);而对稗草只有在0.17g/L处理浓度下显示出轻微的抑制作用,此后也随着浓度的增加而提高,但对胚芽鞘抑制的增长幅度不明显,在0.87g/L和1.74g/L浓度下抑制率分别为74.5%(14.8%)和91.8%(23.1%)。2.2溶剂萃取物的收率依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对600g海桐叶乙醇溶液提取物进行萃取分离,分别得到3种溶剂萃取相和水相的干物质97.5g、180.6g、115.8g和125.4g,计算收率分别为16.3%、30.1%、19.3%和20.9%。各萃取物对生菜、小麦、夏至草及稗草4种受体植物幼苗生长的影响如下。2.2.1种子根、胚芽剑和胚芽剑石油醚相在0.05~5.0g/L的处理浓度下对4种受体植物幼苗生长的抑制率分别为:生菜胚根(20.7%、34.4%、36.5%、44.0%和70.9%)和胚轴(13.2%、26.2%、30.4%、34.3%和51.6%)、小麦种子根(21.7%、31.6%、36.5%、47.9和72.0%)和胚芽鞘(10.3%、15.2%、20.4%、24.9%和35.9%)、夏至草胚根(15.4%、16.3%、36.6%、48.6%和81.5%)和胚轴(13.3%、16.8%、35.8%、46.0%和59.2%)及稗草种子根(9.8%、18.0%、56.0%、66.4%和77.0%)和胚芽鞘(8.8%、14.4%、27.6%、38.4%和42.1%)(图2)。计算有效中浓度分别为生菜胚根(1.047g/L)和胚轴(4.839g/L)、小麦种子根(0.934g/L)和胚芽鞘(>5g/L)、夏至草胚根(0.871g/L)和胚轴(1.855g/L)及稗草种子根(0.575g/L)和胚芽鞘(>5g/L)。2.2.2胚芽剑和胚芽剑乙酸乙酯相在0.05~5.0g/L的处理浓度下对4种受体植物幼苗生长的抑制率分别为:生菜胚根(23.4%、32.9%、46.0%、57.8%和89.1%)和胚轴(18.5%、26.2%、30.6%、42.7%和60.7%)、小麦种子根(21.5%、23.5%、37.7%、51.8%和85.3%)和胚芽鞘(11.8%、12.0%、16.1%、31.6%和67.3%)、夏至草胚根(41.0%、54.6%、66.2%、88.1%和99.8%)和胚轴(35.0%、37.4%、52.7%、64.1%和84.2%)及稗草种子根(35.6%、56.8%、63.1%、69.8%和88.5%)和胚芽鞘(18.3%、33.8%、35.3%、46.4%和72.2%)(图3)。计算有效中浓度分别为生菜胚根(0.409g/L)和胚轴(2.127g/L)、小麦种子根(0.647g/L)和胚芽鞘(2.667g/L)、夏至草胚根(0.095g/L)和胚轴(0.262g/L)及稗草种子根(0.118g/L)和胚芽鞘(0.987g/L)。2.2.3胚芽剑和胚芽剑正丁醇相在0.05~5.0g/L的处理浓度下对4种受体植物幼苗生长的抑制率分别为:生菜胚根(16.0%、25.2%、67.3%、79.2%和89.9%)和胚轴(18.1%、21.7%、47.1%、57.4%和70.2%)、小麦种子根(31.5%、60.5%、73.3%、81.4%和87.4%)和胚芽鞘(7.2%、18.8%、27.9%、31.7%和52.9%)、夏至草胚根(35.9%、51.0%、88.5%、95.7%和99.6%)和胚轴(13.6%、30.0%、54.1%、73.0%和85.5%)及稗草种子根(46.9%、71.0%、85.6%、93.1%和93.8%)和胚芽鞘(14.1%、18.9%、25.0%、25.7%和42.2%)(图4)。计算有效中浓度分别为生菜胚根(0.287g/L)和胚轴(0.767g/L)、小麦种子根(0.094g/L)和胚芽鞘(4.085g/L)、夏至草胚根(0.089g/L)和胚轴(0.377g/L)及稗草种子根(0.012g/L)和胚芽鞘(>5g/L)。2.2.4胚芽剑和胚芽剑水相在0.05~5.0g/L的处理浓度下对4种受体植物幼苗生长的抑制率分别为:生菜胚根(12.1%、17.0%、30.1%、36.8%和71.0%)和胚轴(18.5%、20.6%、25.2%、29.9%和61.0%)、小麦种子根(24.0%、25.9%、35.0%、36.7%和55.3%)和胚芽鞘(7.2%、8.3%、19.9%、20.9%和30.6%)、夏至草胚根(2.0%、12.1%、36.7%、55.0%和94.7%)和胚轴(6.9%、20.6%、40.0%、50.8%和80.1%)及稗草种子根(10.8%、12.1%、19.3%、33.5%和53.7%)和胚芽鞘(15.2%、23.1%、41.7%、45.3%和56.9%)(图5)。计算有效中浓度分别为生菜胚根(1.625g/L)和胚轴(3.654g/L)、小麦种子根(3.723g/L)和胚芽鞘(>5g/L)、夏至草胚根(0.717g/L)和胚轴(0.850g/L)及稗草种子根(4.462g/L)和胚芽鞘(1.840g/L)。3海桐各器官的除草活性研究植物的化感作用是一种普遍现象,几乎存在于所有的植物当中,只是不同种植物之间、同种植物的不同器官之间、甚至于同种植物生长在不同的环境条件时,所表现出的化感活性大小会有较大的差异。笔者通过对200多种园林植物、作物及杂草不同器官化感活性的研究充分的验证了这一点[14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]。研究发现,不仅植物种之间存在竞争,特别是外来入侵物种与当地种之间的竞争与化感作用密切相关,而且,许多作物的连作障碍、生态域中物种之间的平衡保持等都与植物化感作用有关。植物的化感作用主要包括供体植物所产生的化感物质对其他受体植物生长的抑制作用(除草作用)、刺激生长作用及对供体植物自身的自毒作用3个方面。其中,有效利用化感物质的抑制作用或除草作用来开发生物源除草剂是目前国内外研究的热点。笔者通过前期研究,在国内外首次发现园林植物海桐各器官均具有很强的化感作用(除草作用),且以叶器官的活性最高。海桐是一种适应性很强的植物,叶亮、花香、果美,耐干旱,耐高温,高温达35℃不萎蔫,低温-5℃仍呈翠绿色,很少有病虫。长期以来,对该植物的利用主要以园林绿化和观赏为主,兼具一定的药用价值。近年来,随着其农用杀菌和除草活性的不断发现,为有效利用该植物提供了科学依据。本研究在前期研究的基础上,进一步测定了该植物叶器官乙醇溶液提取物及其不同溶剂萃取相对生菜、小麦、夏至草和稗草4种受体植物的除草活性,证实了它们对各受体植物幼苗生长的抑制活性及其开发应用前景。根据所得4个萃取相的有效中浓度可知,在双子叶受体植物中,对杂草夏至草胚根和胚轴抑制的EC50值明显低于抑制栽培植物生菜胚根和胚轴生长所需要的浓度;同样,在单子叶指示植物中,对杂草稗草种子根和胚芽鞘抑制所需的浓度也低于对作物小麦抑制所需的浓度,说明各萃取相中所含有的活性物质对不同的受体植物具有一定的选择性作用。由于3种溶剂萃取相及水相对4种受体植物的除草活性都表现出较高的活性,说明在4个萃取相中均存在高活性除草物质,且种类比较复杂,而且水溶性和脂溶性的活性物质都有可能存在,这为进一步纯化分离增加了难度。目前尚未见到其他与海桐除草活性物质提取分离相关的报道。鉴于许多情况下植物体内除草活性的表现是多种化合物的协同效应,因此,探索对其乙醇溶液粗提物的直接利用也是今后研究的重点之一。尽管一些研究者已从海桐叶中分离出挥发油壬烷、月桂烯、rhamnoglucosyl-3-isorhamnetin、pittosporatobirasideA