宏基因组测序讲解

宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与有关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术介绍宏基因组(Metagenome)(也称微生物环境基因组MicrobialEnvironmentalGenome,或元基因组)。是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为"thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature",即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，现在重要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学(或元基因组学，metagenomics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功效基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群构造、进化关系、功效活性、互相协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究办法。普通涉及从环境样品中提取基因组DNA,进行高通量测序分析，或克隆DNA到适宜的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。宏基因组(Metagenome)(也称微生物环境基因组MicrobialEnvironmentalGenome,或元基因组)。是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为"thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature",即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，现在重要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学(或元基因组学，metagenomics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功效基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群构造、进化关系、功效活性、互相协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究办法。普通涉及从环境样品中提取基因组DNA,进行高通量测序分析，或克隆DNA到适宜的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。特定生物种基因组研究使人们的认识单元实现了从单一基因到基因集合的转变，宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动规律。在现在的基因构造功效认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因构成为研究和开发的重要对象。细菌宏基因组细菌人工染色体文库筛选和基因系统学分析使研究者能更有效地开发细菌基因资源，更进一步地洞察细菌多样性。如宏基因构成为生物催化剂的新来源。宏基因组学研究的方略和基本过程研究方略“宏基因组学”是一种整体性的研究方略，它建立在微生物基因组学的快速发展和聚合酶链式反映广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其方略是从特定环境中直接分离全部微生物DNA，将大片段的DNA克隆到受体菌中体现，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。涉及两个方面[920]：①宏基因组文库的构建：宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术办法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了某些特殊的环节和对策。普通涉及样品总DNA的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]。②宏基因组文库的筛选：根据其研究目的，宏基因组文库筛选普通有功效筛选(functionalscreening)和序列筛选(sequencebasedscreening)两种办法。2宏基因组学的研究环节基因组学的研究过程，普通涉及从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA到适宜的载体，导入宿主菌体，筛选目的克隆等4个环节。特别要指出的是，在基因组学研究领域中，其研究目的普通是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因组学中，则是要测定由多个微生物构成的复杂群体(community)的混合基因组序列。这种差别的核心就是，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材料。2.1分离特定环境生物DNA办法上不同于传统的先培养微生物再提取DNA的做法，而是首先直接受集能够代表特定生物环境生物多样性的样品；然后运用多个理化办法破碎微生物，使其释放DNA，再运用密度梯度离心等办法进行分离纯化。2.2纯化的大分子量DNA进行克隆在对DNA酶切或者超声打断解决，并与适宜的载体DNA进行连接，构建重组体。2.3将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系例如转入大肠埃希菌中，使那些以前无法研究的不可培养微生物的DNA在模式微生物中得到复制、体现，进而得到研究。全部带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。2.4对宏基因组文库的DNA进行分析基于不同的研究目的，有诸多分析办法，重要分为两类：一类为表型功效筛选，即运用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。例如从文库中筛选能体现抗菌物质的克隆。功效分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。另一类为序列基因型分析，即对文库中全部或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究。例如分析文库中16SrRNA序列，对所硕士态环境的多样性进行评定。一种典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽量多地分析DNA序列所编码的信息。3宏基因组学的技术办法宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功效基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群构造、进化关系、功效活性、互相协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究办法。宏基因组学的研究方略和办法大致相似，现按照宏基因组学研究的基本过程和方略对惯用办法和技术予以简要介绍。3.1样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集提取的样品DNA必须能够代表特定环境中微生物的种类，尽量代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的核心之一。要采用适宜的办法，既要尽量地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇[45]。因此总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作，谨防污染，并且保持DNA片段的完整和纯度。已有许多商品化宏基因组DNA提取试剂盒可用，同时诸多实验室仍致力于宏基因组DNA提取办法的改善[68]。惯用的提取办法有直接裂解法和间接提取法(细胞提取法)。直接裂解法是将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中解决，继而抽提纯化，涉及物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的提取办法差别在于细胞破壁的方式不同。此法操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好，但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以完全去除酚类物质。细胞提取法先采用物理办法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的办法抽提DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。此法可获得大片段DNA(20-500kb)且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下某些细胞壁较厚的微生物DNA也不容易抽提出来。为了更加好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的办法对感爱好的目的基因或基因组进行富集[911]，一种比较好的富集办法是稳定同位素示踪技术[12]。克制性消减杂交技术[13]是克制性与消减杂交技术相结合的更简朴、更快速的分离差别基因的办法。该办法不仅运用了消减杂交技术的消减富集，同时也运用了克制性技术进行了高效率的动力学富集，因此该技术是一项富集特定基因、证明微生物之间基因不同的非常有用的技术办法。3.2宏基因组文库的建立宏基因组文库的构建方略取决于研究的整体目的。偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。基因文库的建立过程中需要选择适宜的克隆载体和宿主菌株。传统的办法是直接运用体现载体构建宏基因文库，但是体现载体可插人的宏基因片段普通不大于10kb。克隆中宿主菌株的选择重要考虑到转化效率、宏基因的体现、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目的性状的筛选等。现在大肠杆菌是最为惯用的宿主[14]，另外，链霉菌和假单胞菌也能够作为构建文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差别，不同的研究目的应选择不同的宿主菌株。3.3宏基因组文库的筛选由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高敏捷度的办法来筛选和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为四类:①基于核酸序列差别分析；②基于目的克隆功效的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的体现；④基于涉及稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其它技术。.3.1基于序列的筛选办法普通根据已知有关功效基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。用这种办法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一方略能够分离已知基因家族的新组员和含有高度保守区的酶基因[1516]。另一种办法是对含有16SrRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序[17]。优点是不必依赖宿主菌株来体现克隆基因，缺点是必须对有关基因序列有一定的理解，文库中那些和现有基因序列完全不同的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因组员有一定的局限性，也很难获得全序列。直接序列分析法(sequencedrivenscreeningmethod)是对所构建宏基因组文库的克隆进行随机测序分析，显然能够得到最多的信息[1820]。也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人力、物力及财力。即使DNA序列分析技术不停发展，但与个体微生物基因相比，宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为困难，结合其它的筛选办法能够得到更多的信息。用微阵列技术(基因芯片)进行初步筛选，能够很大程度上减少测序量和后续的序列拼接等工作量。但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等造成的特异性低、敏捷度较差等缺点外，同样不能用于对未知功效基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列[2122]。3.3.2基于功效的筛选办法功效性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化适宜的办法从基因组文库中获得含有特殊功效的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。由于基于活性的筛选不需要已知序列的信息，故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物。功效性筛选的办法有两种，一种是对含有特殊功效的克隆子进行直接检测，如运用其在选择性培养基上(如含有化学染料和不可溶的或发光的酶反映底物)的表型特性进行筛选[23]。这种办法含有较高的敏捷度，可检测到较少的目的克隆。另一种办法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功效互补生长的特性进行[24]。功效性筛选法的优点是筛选过程比较简朴、快速，只要基因能体现，就能够根据基因体现特性进行筛选，不需要复杂的实验过程。局限性之处是这种筛选办法依赖于目的基因在新的宿主中体现，但使用模式微生物并不能把全部的宏基因组DNA体现出来，并且规定克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得基因没法体现，也就不能根据功效进行筛选，故检出的概率很低，工作量大，往往从上万个克隆中只能筛选到几个有用的克隆。3.3.3底物诱导基因体现筛选(substrateinducedgeneexpressionscreening,SIGEX)SIGEX是用于能运用多个底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用来筛选代谢有关基因及酶基因[25]。由于编码有关代谢基因或酶基因普通呈簇存在，普通与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才体现，反之则不体现。首先构建一种含有绿色荧光蛋白(GFP)的体现载体，这个载体可将宏基因组DNA克隆到GFP基因上游，使该基因的体现受到宏基因组DNA片段中的启动子调控。当外加目的底物时，能够影响GFP的体现，进而通过活细胞荧光分离技术(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)，在添加特定底物的条件下对体现库进行筛选，就能够得到对该底物含有代谢活性的克隆。SIGEX在宏基因组研究中含有诸多优势，它提供了一种有效的和经济的检测手段，大大增加了筛选的容量和效率，节省了时间，为高通量筛选提供了保障，并且不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需紧张因修改底物而产生毒性；且能够从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功效。而SIGEX法的局限性之处是目的基因的构造性和适应性很敏感，同时，无法用于分析不能进入细胞质的底物，并且FACS对进样设备的规定也比较高；代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都相邻；同时有些基因的体现除了受底物诱导外，还可能受其它因子的诱导，而有些基因并不需要诱导，是本底水平体现的，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导体现。但是考虑到宏基因组文库中含有大量的基因，其中必然有一部分是可诱导的，是能够被该技术检测到的。因此只要对这些局限性之处进行优化，选择适宜的条件，SIGEX法仍然是一种宏基因组文库筛选的有效办法，特别适合于在工业上使用[26]。3.3.4基于稳定性同位素技术筛选办法含有相似原子序数但不同中子数目且不具放射性的元素称为稳定同位素(stableiso