实验三 DNA的Feulgen染色法

实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察

DNA是主要的遗传物质，主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内。自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。

一、实验目的

1了解Feulgen反应的基本原理。2熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。3掌握细胞分裂各期的主要特点。

二、实验原理

DNA经弱酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。三、试剂1.Carnoy固定液：3份95%酒精加入1份冰醋酸。2.1mol/LHCL：准确量取86.2ml浓盐酸（比重1.18）加入到93.8ml蒸馏水中。3.Schiff试剂：称1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸馏水中，5分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入1N

HCl

20ml，继续冷却至25℃，加入1g偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是Schiff试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。

4.亚硫酸水溶液(漂白液)：在200ml蒸馏水中，加入10ml

1N

HCl

和10ml

10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g固体）。此液在临用前配制。否则会因SO2的的逸出而失效。5.5%三氯乙酸6.0.5%固绿酒精溶液（95%的酒精溶解）

四、实验材料及实验器材1.材料Carnoy液固定的大蒜根尖洋葱根尖纵切永久制片马蛔虫卵切片永久制片2.实验器材显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、剪刀、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、镜头纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒。

五、实验方法和步骤（一）材料准备

取大蒜若干头，剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长1cm时，剪下根尖固定在Carnoy固定液内、保存备用。（二）水解

实验时，从冰箱取出预先准备好的大蒜根尖，分装到若干个青霉素瓶中，用自来水洗3次，蒸馏水水洗3次，换1mol/L

HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1mol/LHCl

3ml，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解8-15分钟（视材料而定，水解时间可以从8分钟延长至30分钟）。然后吸去热1mol/LHCl，换入冷1mol/LHCl洗1次，再用蒸馏水将根尖洗3次。

水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中；反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。

（三）染色

吸净水分，加入Schiff试剂避光染色40min~60min，用漂洗液漂洗2～3次，每次5min,然后经自来水流水冲洗，再用蒸馏水洗2次后准备压片。（四）压片法

取一根尖置于载玻片上，用刀片切下生长区部位（染成紫红色），加一滴0.1%亮绿水溶液对染一分钟，吸去亮绿液，加一滴清水或45%醋酸水溶液，加盖玻片，用拇指轻压使细胞分散均匀，镜检。（五）对照组预先用5%三氯醋酸（90℃）处理15min，然后再依次进行实验步骤（二）（三）（四）。

六、有丝分裂各期观察1大蒜根尖压片的观察

首先在低倍镜下，区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞，然后，在高倍镜下，观察细胞核的形态，注意在你的片子上，是否有有丝分裂细胞，如有，你能找到细胞分裂期的几个阶段，其特征如何？（可参照附录）

附录：植物细胞分裂的几个时期。

细胞周期分为间期及分裂期，按照有无核膜，核仁、染色体，以及染色体形态与分布位置的变化，细胞有丝分裂又分为前期、中期、后期和末期四个阶段。现将各期特点简述如下，

（1）前期：此期的染色质螺旋盘绕成一定数目的细而长的染色丝，此即染色体。染色体先是分散于核液中，以后，逐渐向核膜移动，在此时，核仁逐渐消失，核膜溶解。

（2）中期：染色体进一步盘绕，变短变粗，在细胞的中央（即赤道板）规则地排列成行，仔细观察，可看到染色体两侧的纺锤丝。

（3）后期：姊妹染色体分别向细胞两极移动，染色体达到两极时染色体紧缩成团，染色体的轮廓逐渐变得不清楚，细胞质中间部位（细胞的赤道板）形成细胞板。（4）末期：盘绕变粗的染色体又伸展开，此时，核仁、核膜又重新出现。

此外，间期细胞的细胞核有下述特点：核膜清楚，核内结构均匀，除异染色质外，可见1－2个着色较深的核仁。而在进入细胞分裂期的细胞核，一般均大于间期细胞核。植物细胞的细胞质分裂2洋葱根尖纵切永久制片观察（同大蒜根尖）3马蛔虫受精卵切片永久制片观察马蛔虫是真核生物中染色体数目最少的物种，二倍体马蛔虫的染色体数目为2条或4条，三倍体为6条。在观察切片时要注意所观察卵的染色体数目的不同。注意：1)马蛔虫受精卵是动物细胞，在细胞分裂过程中与植物细胞有所不同。首先最明显的不同就是，植物细胞的赤道板在后期可形成细胞